Generación de SRAS

Jul 05, 2023

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 3334 (2023) Citar este artículo

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Los pacientes con COVID-19 con riesgo de enfermedad grave pueden tratarse con anticuerpos monoclonales neutralizantes (mAb). Para minimizar el escape del virus de la neutralización, estos se administran como combinaciones, por ejemplo, casirivimab+imdevimab o, para anticuerpos dirigidos a regiones relativamente conservadas, individualmente, por ejemplo, sotrovimab. La vigilancia genómica sin precedentes del SARS-CoV-2 en el Reino Unido ha permitido un primer enfoque del genoma para detectar la resistencia emergente a los medicamentos en los casos de Delta y Omicron tratados con casirivimab+imdevimab y sotrovimab respectivamente. Las mutaciones ocurren dentro de los epítopos de anticuerpos y para casirivimab+imdevimab, múltiples mutaciones están presentes en lecturas sin procesar contiguas, lo que afecta simultáneamente a ambos componentes. Usando resonancia de plasmón superficial y ensayos de neutralización pseudoviral, demostramos que estas mutaciones reducen o anulan por completo la afinidad de los anticuerpos y la actividad neutralizante, lo que sugiere que están impulsadas por la evasión inmune. Además, mostramos que algunas mutaciones también reducen la actividad neutralizante del suero inducido por la vacuna.

Los casos de infección por SARS-CoV-2 se informaron por primera vez a fines de diciembre de 2019 en Wuhan1, y el virus provocó rápidamente una pandemia mundial de enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19). Hasta junio de 2022, se han notificado más de 500 millones de casos, con más de seis millones de muertes (https://covid19.who.int/). Al ser un virus de ARN de cadena positiva, aunque su polimerasa tiene cierta capacidad de corrección, el SARS-CoV-2 ha evolucionado rápidamente con miles de mutaciones ya identificadas2. Ciertas mutaciones pueden conferir ventajas de aptitud al aumentar la transmisibilidad o permitir la evasión de las respuestas humorales inducidas por la infección natural o la vacunación.

Desde que comenzó el brote, varias variantes de preocupación (VoC) (https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/variants/variant-classifications.html) han surgido como cepas dominantes a nivel mundial3,4,5 o regionalmente6, 7. Estas variantes contienen múltiples mutaciones que se encuentran principalmente en el gen que codifica el pico viral, la principal glicoproteína de superficie crucial para la infección viral. El dominio de unión al receptor (RBD) de la espiga, que inicia la entrada viral en la célula huésped al interactuar con el receptor ACE2 del huésped, es el principal objetivo de los potentes anticuerpos neutralizantes (mAb). Los mAbs se dirigen al RBD de dos maneras diferentes: la mayoría se unen a una región en la superficie de unión a ACE2 del RBD o muy cerca de ella, por lo que evitan la interacción del pico con ACE2 y, por lo tanto, bloquean la infección8,9, otros se unen a no-ACE2 sitios de bloqueo en el RBD, y estos mAbs pueden funcionar para desestabilizar el pico trimérico10,11,12.

El tratamiento farmacológico puede impulsar la evolución de los patógenos, lo que conduce a una rápida selección de mutaciones ventajosas y la aparición de cepas resistentes13. Este proceso puede resultar en el fracaso del tratamiento; y la propagación de la resistencia puede causar nuevas oleadas de infecciones. Los mAbs generalmente se prescriben en poblaciones vulnerables donde las infecciones persisten debido a la inmunosupresión del huésped, lo que aumenta aún más la probabilidad de aparición de resistencia (https://assets.publishing.service.gov.uk/government/uploads/system/uploads/attachment_data/file/ 1039516/S1430_NERVTAG_Antiviral_drug_resistance_and_use_of_Direct_Acting_Antiviral_Drugs_.pdf). Existen potencialmente dos formas de evitar el escape mutacional. En primer lugar, se puede desarrollar un cóctel de terapias para unir simultáneamente diferentes sitios en el objetivo, lo que significa que para escapar, el patógeno necesitará desarrollar dos o más mutaciones, lo que reduce drásticamente las posibilidades de escape. Los cócteles de fármacos se utilizan para prevenir la generación de mutaciones de escape por varios patógenos como el VIH14 y la TB15. REGEN-COV es una combinación de dos mAbs no competitivos completamente humanos, casirivimab (REGN10933) e imdevimab (REGN10987), los cuales se dirigen a la interfaz de unión a ACE2 del SARS-CoV-2 RBD y funcionan para bloquear la interacción RBD/ACE216. Los experimentos in vitro demostraron que la combinación podría neutralizar los mutantes seleccionados17 (https://www.covid19treatmentguidelines.nih.gov/therapies/anti-sars-cov-2-antibody-products/anti-sars-cov-2-monoclonal-antibodies/ ) utilizando componentes individuales18,19. Un informe anterior también sugirió que es poco probable que el tratamiento con REGEN-COV conduzca a la aparición de mutantes de escape tanto en estudios preclínicos como en humanos20.

Una segunda estrategia terapéutica para prevenir la acumulación de mutaciones de escape sería desarrollar terapias dirigidas a un epítopo altamente conservado que está restringido mutacionalmente, es decir, una mutación de dicho epítopo tendría un alto costo de aptitud para el patógeno, anulando cualquier ventaja de selección. . Sotrovimab (VIR-7831/S309) se une en la región del glicano unido a N en la posición 343 del SARS-CoV-2 RBD; aunque no interfiere con la unión de ACE2, es capaz de neutralizar eficazmente el virus21. Dado que este epítopo está relativamente bien conservado entre los aislamientos humanos y animales de los sarbecovirus de los clados 1, 2 y 3 (incluido el SARS-CoV-1)21, el sotrovimab (desarrollado a partir de un mAb aislado de un caso infectado por el SARS-CoV-1) se consideró un amplio neutralizador y quizás capaz de resistir el escape mutacional incluso como monoterapia. Sin embargo, el epítopo es susceptible a la mutación con sotrovimab y muestra una reducción de aproximadamente seis veces en la neutralización de la variante Omicron5.

En este trabajo, informamos la detección de mutaciones virales que están asociadas con la resistencia a los medicamentos en pacientes tratados con REGEN-COV (para la infección con la variante Delta) y sotrovimab (para la infección con las variantes Omicron). Hacemos uso del esfuerzo de vigilancia genómica sin precedentes desplegado para el SARS-CoV-2 en el Reino Unido y desarrollamos un enfoque genómico para detectar la resistencia emergente a los medicamentos (https://assets.publishing.service.gov.uk/government/uploads/system/ uploads/attachment_data/file/1090992/11072022_SARS-CoV-2_Therapeutics_Technical_Briefing_4.pdf). Evaluamos el comportamiento de unión de estos mutantes virales utilizando resonancia de plasmones superficiales (SPR) y examinamos su impacto en la actividad neutralizante de los anticuerpos terapéuticos utilizando ensayos pseudovirales. Sorprendentemente, se encuentra que la variante Delta adquiere mutaciones en dos sitios distintos a los que se dirigen casirivimab e imdevimab respectivamente, lo que da como resultado un deterioro grave de la actividad neutralizante del cóctel. Además, se encontró que la variante Omicron BA.1 obtiene mutaciones individuales en múltiples sitios, lo que anula por completo la actividad de unión y neutralización de sotrovimab. Finalmente, el título de neutralización de los sueros vacunales frente a estos mutantes de escape se reduce significativamente en comparación con la cepa original (es decir, variantes Delta o BA.1).

El presente análisis incluye a todos los pacientes que habían recibido tratamiento en el Reino Unido, de los que se había recogido al menos una muestra antes del 12 de abril de 2022, de los que se disponía de una secuencia genética viral y cuya infección se había clasificado como Delta, BA.1 o BA .2. Nuestro análisis comprendió 17 284 secuencias muestreadas de 12 927 pacientes antes del tratamiento (Tabla 1, Tabla Sup 1). En el análisis principal, las secuencias se consideraron posteriores al tratamiento si se tomaron muestras de los pacientes al menos 10 días después del día del tratamiento: 1627 secuencias de 938 pacientes tratados con casirivimab+imdevimab, molnupiravir, nirmatrelvir más ritonavir (Paxlovid), remdesivir o sotrovimab .

Comparamos las frecuencias de aminoácidos entre las secuencias previas y posteriores al tratamiento. análisis de estratificación por tratamiento, variante (Delta, BA.1 o BA.2) y gen. Nueve residuos de aminoácidos mostraron un cambio de frecuencia significativo (p < 0,001, prueba de Fisher unilateral) en las secuencias posteriores al tratamiento en comparación con las secuencias previas al tratamiento, lo que sugiere una posible evidencia de selección. Todas las sustituciones que surgieron del tratamiento estaban en la región RBD del pico: E406D/Q, G446S/V, Y453F y L455F/S en pacientes infectados con Delta y tratados con casirivimab+imdevimab; P337R/S y E340A/D/K/V, K356T y R493Q en pacientes infectados con BA.1 y tratados con sotrovimab; y E340K en pacientes infectados por BA.2 y tratados con sotrovimab (fig. 1). Para molnupiravir, remdesivir y paxlovid, no se observaron mutaciones significativas (p < 0,001) en los datos disponibles.

a Pacientes infectados con Delta y tratados con casirivimab/imdevimab (n = 1557 pretratamiento y n = 67 postratamiento), b Pacientes infectados con BA.1 y tratados con sotrovimab (n = 3221 pretratamiento y n = 148 postratamiento) -tratamiento), y c pacientes infectados con BA.2 y tratados con sotrovimab (n = 1338 pretratamiento y n = 25 postratamiento). Las frecuencias de aminoácidos se compararon entre las muestras antes y después del tratamiento (al menos 10 días después del tratamiento) en cada sitio en la alineación de la secuencia de picos. Los valores de p para cada sitio se calcularon utilizando una prueba de Fisher unilateral, y los valores de p se transformaron logarítmicamente y se invirtieron para su visualización, de modo que los sitios con valores divergentes aparezcan más arriba en la figura. Solo se muestran los sitios con cierta variabilidad (>1 aminoácido). Las líneas horizontales indican umbrales de valor p de p < 0,001, p < 0,0001, etc. Los residuos con frecuencias divergentes (p < 0,001) se resaltan en rojo, con el cambio de aminoácido observado indicado en el texto. Los residuos que se sabe que interactúan con cada fármaco se indican en azul y morado en la parte superior de la figura. Nueve sitios están resaltados en rojo en la figura: E406D/Q (p = 9 × 10−4), G446S/V (p < 10−16), Y453F (p = 0,000809) y L455F/S (p = 9 × 10 −6) en pacientes infectados con Delta y tratados con casirivimab+imdevimab; P337R/S (p < 10−16) y E340A/D/K/V (p < 10−16), K356T (p < 10−16) y R493Q (p = 1,8 × 10−5) en pacientes infectados con BA .1 y tratados con sotrovimab; y E340K (p = 0,000369) en pacientes infectados con BA.2 y tratados con sotrovimab. Véase también la Figura S1. No se hicieron ajustes para comparaciones múltiples.

Restringiendo el cálculo a los tres grupos con asociaciones identificadas: pacientes infectados con Delta y tratados con casirivimab+imdevimab y pacientes infectados con BA.1 o BA.2 y tratados con sotrovimab (Tabla 1), un total de 86 postratamiento (≥ 10 días) secuencias de 59/240 (24,59 %) pacientes tenían al menos una de las mutaciones identificadas, en comparación con 15 secuencias de 14/6116 (0,20 %) pacientes antes del tratamiento (Tabla 2; p < 10−16, uno- prueba de Fisher lateral). De 1557 pacientes infectados con Delta y tratados con casirivimab+imdevimab, 11 (0,70%) desarrollaron una mutación a los 10 días, frente a 46/3221 (1,43%) pacientes infectados con BA.1 y tratados con sotrovimab y 2/1338 (0,15%) %) de pacientes infectados con BA.2 y tratados con sotrovimab, lo que sugiere tasas de escape comparables para los dos mAb. Once pacientes postratamiento tenían >1 mutación: tres pacientes infectados con Delta tratados con casirivimab+imdevimab tenían una combinación de G446V y L455F, uno tenía G446S y L455S y uno tenía G446V y Y453F. Examinamos las lecturas sin procesar y confirmamos que para todos estos pacientes, ambas mutaciones estaban presentes en la mayoría de las lecturas sin procesar contiguas. Entre los pacientes BA.1 tratados con sotrovimab, cuatro tenían una combinación de E340A y R493Q, uno tenía E340D y R493Q y uno tenía K356T y R493Q.

El análisis se repitió con un umbral diferente para las secuencias posteriores al tratamiento: al menos uno o cinco días después del tratamiento. Si bien los conjuntos de datos eran mucho más grandes cuando se consideraba un intervalo más corto, la fuerza de la señal se hizo más fuerte a medida que se alargaba el intervalo, lo que respalda la validez de nuestros hallazgos (Figura S1).

Dentro de nuestro conjunto de datos, buscamos pacientes con secuencias muestreadas antes y después del tratamiento. Encontramos 25 pacientes con infecciones Delta y secuencias coincidentes, de los cuales siete cambiaron del aminoácido de tipo salvaje a una de las sustituciones emergentes del tratamiento identificadas (Tabla 2). Entre los 49 pacientes BA.1 con secuencias coincidentes, 19 tuvieron un tratamiento- sustitución emergente. El único paciente BA.2 con una secuencia previa y posterior al tratamiento había mutado de E a K en la posición 340.

Finalmente, evaluamos con qué frecuencia ocurrieron las mutaciones emergentes del tratamiento en grupos tratados con un fármaco diferente. En pacientes BA.1/BA.2 que nunca fueron tratados con sotrovimab (n = 985), el 0,25 % tenía la mutación R493Q. En los pacientes Delta que nunca fueron tratados con casirivimab e imdevimab (n = 1555), el 0,34 % tenía las mutaciones G446V. Ninguna de las otras mutaciones se encontró en estos grupos, lo que indica que todas las mutaciones emergentes del tratamiento eran muy específicas del fármaco correspondiente.

Para cada mutación identificada, determinamos su frecuencia en la base de datos genómica del Reino Unido desde septiembre de 2022 en adelante. La frecuencia de las mutaciones enumeradas anteriormente dentro del conjunto de datos genómicos del Reino Unido para mutaciones asociadas con casirivimab e imdevimab en secuencias Delta (n = 763 511) fueron: 6 E406D; 7 E406Q; 163 G446S; 1946 G446V, 12 Y453F; 179 L455F; 1 L455S. La frecuencia de mutaciones post tratamiento con sotrovimab con la variante BA.1 (n = 742.992) fue: 11 P337R; 32 P337S; 39 E340A; 82 E340D; 52 E340K; 5 E340V; 57 K356T; 1214 R493Q. La frecuencia de mutaciones post tratamiento con sotrovimab con la variante BA.2 (n = 407.161) fue: 10 E340K. Mientras que por encima, un total de 86/719 (12,1 %) pacientes después del tratamiento (≥1 día) tenían al menos una de las mutaciones identificadas; la frecuencia de cualquier mutación en las variantes de interés en el conjunto de datos de vigilancia genómica fue solo de 3653/1 862 686 (0,20 %, idéntica a la frecuencia en el conjunto de datos previo al tratamiento; p < 10-16, prueba de Fisher unilateral).

En general, estos datos demuestran un enriquecimiento significativo de mutaciones en las secuencias posteriores al tratamiento en comparación con el grupo de pretratamiento y con la base de datos genómica en su conjunto, lo que las implica fuertemente como mutaciones seleccionadas para escapar de la terapia con mAb.

La figura 2 muestra las posiciones de las mutaciones que se encontró que eran de gran importancia. Todas las mutaciones ocurren en el RBD del pico SARS-CoV-2.

un Modelo del Omicron RBD (7TLY) acoplado con S309 (sotrovimab). Omicron RBD se muestra como una superficie gris desde una vista frontal aproximada, S309 como cintas de dibujos animados con cadenas pesadas y ligeras coloreadas por separado. Los sitios de mutación asignados a la superficie RBD están coloreados en magenta y etiquetados. b Vista de primer plano de la interfaz entre el parche de residuos P337, E340, K356 con la cadena pesada S309. Los enlaces de hidrógeno potenciales y las interacciones hidrofóbicas se muestran como líneas discontinuas verdes. c Modelo del Delta RBD acoplado con REGEN-COV mAbs casirivimab e imdevimab mostrado desde vistas aproximadas frontal (izquierda) y posterior (derecha). Delta RBD se muestra como una superficie gris y los sitios de mutación E406, G446, Y453 y L455 están coloreados en magenta y etiquetados. d Vista de primer plano de la interfaz entre E406, Y453 y L455 con casirivimab. e Vista de primer plano de la interfaz entre G446 e imdevimab. Los enlaces de hidrógeno potenciales y las interacciones hidrofóbicas se muestran como líneas discontinuas verdes.

En la Fig. 2a, las mutaciones asociadas con el tratamiento con sotrovimab se asignan a la estructura del complejo Omicron BA.1 RBD y sotrovimab (7TLY [https://www.rcsb.org/structure/7TLY])22. Tenga en cuenta que los residuos RBD 337, 340 y 356 se agrupan estrechamente formando un punto de interacción con la cadena pesada del anticuerpo CDR3 en particular (Fig. 2b). W105 y F106 de CDR3 forman un sándwich hidrofóbico clave de 4 capas con los residuos 337 y 356 de RBD (W105:P337:F106:K356), mientras que E340 fija el bucle de CDR3 mediante un notable conjunto de interacciones con los nitrógenos de amida de residuos 104-106, que están dispuestos más bien como una hélice abierta rematada con exquisita especificidad por E340. Esto sugiere que las mutaciones observadas P337R/S; E340A/D/K/V; K356T interrumpirá este punto de acceso vinculante. En contraste, Q493R está distal al epítopo, en el borde de la huella de ACE2 (Fig. 2a), por lo que no hay una razón obvia para que esta mutación afecte la unión del anticuerpo.

Las mutaciones asociadas con los tratamientos con casirivimab e imdevimab se muestran en la Fig. 2c, asignadas a la estructura del Delta RBD que contiene la mutación L452R (7ORB [https://www.rcsb.org/structure/7ORB])19, donde la unión de casirivimab e imdevimab se infiere de la estructura informada del complejo con RBD pandémico temprano (6XDG [https://www.rcsb.org/structure/6XDG]), el RMSD en posiciones Cα entre pandémico temprano y Omicron BA.1 RBD es 1,16 Å y estamos seguros de que esta inferencia es segura). Las mutaciones observadas caen en dos áreas en la superficie del RBD. Las posiciones 406, 453 y 455 están agrupadas en la parte posterior de la región del cuello8 que se encuentran debajo de la CDR1 de la cadena pesada de casirivimab y forman un nido de interacciones (Fig. 2d). Se esperaría que estas mutaciones afectaran la unión de este anticuerpo. Por el contrario, G446 descansa estrechamente contra N57 e Y59 de la cadena ligera CDR2 de imdevimab (Fig. 2e) y se esperaría que cualquier cambio en una cadena lateral más grande, como las mutaciones G446S/V observadas, anule la unión.

Construimos un panel de lentivirus pseudotipados23 que expresan el pico de los mutantes de escape identificados (Fig. 3). Los ensayos de neutralización pseudoviral mostraron que la actividad de imdevimab contra el mutante Delta+G446V se eliminó por completo, mientras que casirivimab mostró reducciones >10 veces en el título de neutralización de Delta+Y453F (16 veces), Delta+L455F (17 veces) y Delta+L455S (155 veces), en comparación con la variante Delta de tipo salvaje (Fig. 3A, C)

A Curvas de neutralización pseudoviral de las variantes Delta indicadas con mAb REGEN-COV. La comparación se realiza con Omi-12 A VH1-58 mAb, que no es sensible a las mutaciones encontradas después del tratamiento con REGEN-COV. Los datos se presentan como valores medios ± SEM. n = 2 experimentos biológicamente independientes. B Curvas de neutralización de pseudovirus para mutantes de sotrovimab BA.1. Los datos se presentan como valores medios ± SEM. n = 2 experimentos biológicamente independientes. C, D Media de neutralización IC50 ± títulos SEM para las neutralizaciones que se muestran en A, B.

Dado que casirivimab se mantuvo completamente activo contra el mutante Delta+G446V e imdevimab aún podía neutralizar potentemente los mutantes Delta+Y453F y Delta+L455F/S, la combinación de casirivimab e imdevimab retuvo la potencia de neutralización contra todos estos mutantes únicos. Sin embargo, las mutaciones combinadas de Delta+G446V + Y453F y Delta+G446V + L455F no solo condujeron a la inactivación completa de la actividad neutralizante de imdevimab, sino también a una inactivación grave de la actividad de casirivimab. Como resultado, el título de neutralización de casirivimab+imdevimab se redujo 1097 veces frente a Delta+G446V + Y453F y 318 veces frente a Delta+G446V + L455F. Esto es consistente con el hallazgo de estos pares de mutaciones que ocurren juntas en secuencias únicas de Delta RBD descritas anteriormente.

Para confirmar que los efectos observados sobre la neutralización eran directamente atribuibles al cambio en la interacción RBD/mAb, medimos la afinidad de los mAb y los mutantes RBD por resonancia de plasmón superficial (SPR) (Figs. S2, S3, Tabla 3A). Este análisis también mostró que la mutación G446V casi abolió la unión de imdevimab y, mientras tanto, provocó una reducción modesta (1,8 veces) en la afinidad de unión de casirivimab (Tabla 3A). Las mutaciones únicas L455S, E406D y E406Q afectan principalmente a casirivimab. El análisis SPR mostró una disminución de 369, 20 y 38 veces en la afinidad de casirivimab por Delta+L455S, Delta+E406D y Delta+E406Q respectivamente. El título de neutralización de casirivimab se redujo 65 veces, 2 veces y 12 veces frente a estos tres mutantes respectivamente (Fig. 3C, Tabla 3A). Sin embargo, dado que imdevimab no se vio afectado, la combinación de casirivimab+imdevimab retuvo una potente actividad neutralizante contra estos mutantes.

Curiosamente, se observó un efecto aditivo en la reducción de la unión de casirivimab para la combinación de mutaciones que resultó en una disminución general de 347 veces y una disminución de la afinidad por G446V + Y453F y una disminución de 192 veces por G446V + L455F. Como era de esperar, la unión de imdevimab a Delta+G446V + Y453F y Delta+G446V + L455F se deterioró casi por completo. En general, la adquisición de mutaciones dobles ha provocado una pérdida sustancial de sensibilidad al régimen REGEN-COV.

Las mutaciones BA.1 P337R/S y E340A/D/K/V llevaron a la eliminación completa de la neutralización por sotrovimab (Fig. 3B, D). Aunque BA.1 + R493Q (reversión al tipo salvaje de Wuhan) también se identificó como una mutación emergente posterior al tratamiento, no se observó ningún efecto obvio sobre la actividad neutralizante de sotrovimab. Los RBD de BA.1 + P337R/S y BA.1 + E340A/D/K/V se expresaron con éxito para permitir el examen de su unión con sotrovimab (Figura S3). La afinidad de sotrovimab se redujo de 1951 veces a 20241 veces en comparación con el BA.1 RBD de tipo salvaje, lo que explica por qué estos mutantes eran resistentes a la neutralización de sotrovimab (Tabla 3D).

Los ensayos de neutralización se realizaron utilizando suero obtenido 28 días después de una tercera dosis de la vacuna BNT162b224 de Pfizer-BioNtech (Fig. 4). Después de 3 dosis de BNT162B, se observó una disminución de 1,9 veces y 1,5 veces para Delta+G446V + Y453F y Delta+G446V + L455F respectivamente, en comparación con Delta de tipo salvaje (p < 0,0001); mientras que se observó una reducción de 2, 1,2 y 3,8 veces para BA.1 + P337S, BA.1 + E340K y BA.1 + K356T respectivamente en comparación con BA.1 de tipo salvaje (p < 0,0001, p = 0,0082 y p < 0,0001).

Los títulos de dilución de plasma recíprocos IC50 para mutaciones inducidas por Delta REGEN-COV y mutaciones inducidas por sotrovimab BA.1 se comparan con títulos para la cepa ancestral Victoria, Delta y BA.1. La media geométrica de los títulos se muestra encima de cada columna. Para el análisis se utilizó la prueba de rango con signo de pares emparejados de Wilcoxon y se calcularon los valores de P de dos colas. Los diferentes colores indican diferentes pseudovirus, que se indican debajo del gráfico.

Se ha demostrado que las personas infectadas con la variante Omicron del SARS-CoV-2 actualmente dominante tienen una menor probabilidad de enfermedad grave y hospitalización en comparación con las variantes anteriores. Sin embargo, muchas personas aún padecen enfermedades graves25 y esta proporción podría ser mayor en poblaciones con niveles más bajos de inmunidad inducida por infecciones o vacunas.

Aunque las tasas de mortalidad actuales son mucho más bajas que en 2020 (https://www.ons.gov.uk/peoplepopulationandcommunity/healthandsocialcare/conditionsanddiseases/articles/coronaviruscovid19latestinsights/deaths), en junio de 2022 más de 300 personas morían por COVID-19 cada semana dentro del Reino Unido (https://coronavirus.data.gov.uk/details/deaths). Las personas que no pueden desarrollar una respuesta inmunitaria adecuada a partir de la vacunación o para quienes no se recomienda la vacunación corren un riesgo particular. Es esta población vulnerable, que tiende a sufrir infecciones crónicas por COVID-19, la que se dirige a recibir terapias con mAb, ya sea terapéutica o profilácticamente. En el Reino Unido, los subgrupos clínicos de mayor riesgo que están inmunodeprimidos son elegibles para estas terapias (https://www.gov.uk/government/publications/higher-risk-patients-eligible-for-covid-19-treatments-independent -informe-del-grupo-asesor/definición-de-los-subgrupos-clínicos-de-mayor-riesgo-en-la-infección-comunitaria-con-sars-cov-2-al-considerar-el-uso-de-anticuerpos-monoclonales-neutralizantes).

Si bien se ha demostrado que los mAbs terapéuticos anti-SARS-CoV-2 comerciales son tratamientos efectivos para COVID-1926,27, varios estudios han informado reducciones severas o la eliminación total de sus actividades neutralizantes contra las variantes de Omicron5,22,28,29. Como se demostró que sotrovimab no podía neutralizar efectivamente Omicron BA.2, en abril de 2022 la FDA anunció que sotrovimab ya no estaba autorizado para tratar COVID-19 ya que BA.2 se convirtió en la variante dominante (https://www.fda.gov /drugs/drug-safety-and-availability/fda-updates-sotrovimab-emergency-use-authorization) y en el Reino Unido, sotrovimab ya no se usa ampliamente.

En un estudio reciente, se informó que la variante Delta desarrolló mutaciones de resistencia P337L/T y E340K/A/V en pacientes tratados con sotrovimab30. Aquí informamos la identificación de mutaciones de escape BA.1 en pacientes que recibieron tratamiento con sotrovimab. Además de las mutaciones que ocurren en los residuos P337 y E340, también identificamos una nueva mutación K356T. Estas mutaciones suprimen la actividad de unión y, por lo tanto, neutralizante de sotrovimab. También se encuentra Q493R, una reversión a la secuencia encontrada en los primeros virus pandémicos y en BA.4/5. Esta mutación es distal a la huella de sotrovimab, no tiene efecto sobre la unión de anticuerpos, pero se ha informado que aumenta la afinidad por ACE2 (Wang et al., 2022), lo que sugiere que la unión mejorada del receptor en lugar de escapar de la unión del anticuerpo puede ser el factor impulsor de la selección. . Estas observaciones sugieren que es probable que la monoterapia se vea afectada por variantes emergentes e induzca resistencia emergente del tratamiento, incluso si el fármaco se dirige a un epítopo que está relativamente conservado entre los sarbecovirus.

En contraste con el agente único sotrovimab, se esperaría que el régimen REGEN-COV, que contiene una combinación de dos mAbs que se dirigen a epítopos que no se superponen, sea más resistente al escape mutacional. De hecho, estudios previos han demostrado que REGEN-COV fue capaz de prevenir eficazmente la aparición de mutantes de escape no solo in vitro, sino también en estudios in vivo en animales y humanos18,20. Sin embargo, en nuestro estudio detallado, observamos que el tratamiento con el agente dual REGEN-COV condujo, en algunos individuos, a que la variante Delta adquiriera pares de mutaciones que perjudican simultáneamente la unión de ambos componentes de REGEN-COV, lo que lleva a hasta 1000 -Reducción de veces en los títulos de neutralización. Todas las mutaciones que identificamos se predijeron en un ejercicio de mapeo en el que se probó el impacto de cada mutación potencial en la proteína espiga. El estudio reveló que los pseudovirus con una mutación E406W pudieron escapar de ambos compuestos REGEN-COV31. Esta mutación no ocurrió en nuestro pequeño conjunto de datos. Se requieren dos cambios de nucleótidos para este cambio de aminoácido; sin embargo, se identificaron cambios de un solo nucleótido en el sitio y se encontró que eran significativos.

No está claro cómo el virus pudo ganar las mutaciones de resistencia combinadas durante la terapia, sin embargo, se ha documentado una evolución viral acelerada en pacientes inmunocomprometidos que podrían sufrir infecciones persistentes por SARS-CoV-2 durante muchos meses, con mutaciones encontradas predominantemente en el RBD. y otras regiones de la espiga32. Una posibilidad es que los virus que albergan mutaciones resistentes a un componente de REGEN-COV ya hayan surgido en dichos pacientes antes del tratamiento combinado, y el medicamento luego impulsó la selección de una segunda mutación, lo que provocó un deterioro general de la terapia, quizás acelerado. por recombinación viral. Si la evolución acelerada del virus ha facilitado el escape a través de un efecto espectador (por ejemplo, mutaciones impulsadas por la modulación de la unión del receptor), este podría ser un argumento adicional para intentar encontrar anticuerpos neutralizantes que se unan en regiones más conservadas, aunque encontramos que se selecciona una mayor afinidad por el receptor. en algunos pacientes infectados con BA.1 tratados con sotrovimab, que se une a un epítopo relativamente conservado. Sin embargo, se identificaron virus con mutaciones de escape únicas en pacientes bajo el tratamiento con REGEN-COV. En una terapia de combinación eficaz, estos mutantes serían neutralizados por uno de los componentes. Esto plantea la cuestión de si la concentración de los mAb podría no alcanzar el nivel deseado in vivo, por ejemplo, debido a una biodisponibilidad limitada o diferencial en ciertas partes del cuerpo, lo que crea un entorno favorable para que los virus desarrollen resistencia. No se disponía de muestras de pacientes para probar la neutralización endógena previa al tratamiento.

La forma más sencilla de mitigar el escape es probablemente usar un cóctel más complejo de mAbs no competitivos; de hecho, se ha demostrado que tal combinación pudo retener la potencia antiviral durante hasta once pases en serie consecutivos20. Combinar mAbs con antivirales es otra opción, o idear enfoques clínicos basados ​​en el perfil del paciente junto con el uso de la dosis correcta para la biodisponibilidad. También podría ser importante realizar el genotipado de las variantes antes de la administración de la terapia con mAb, particularmente en casos de inmunodepresión crónicamente infectados33. Sin embargo, los pacientes a los que se les prescribió el tratamiento para las infecciones por COVID-19 generalmente comienzan la terapia el mismo día, por lo que el tiempo de respuesta entre el muestreo y el análisis de la secuencia tendría que acortarse sustancialmente para uso clínico.

Finalmente, es preocupante que el título de neutralización del suero de la vacuna se redujera frente a los mutantes de escape desarrollados a partir de ambos regímenes de tratamiento en dos variantes de virus diferentes. Esto no es del todo sorprendente, ya que los mAbs elegidos para uso terapéutico se dirigen a importantes epítopos neutralizantes en el SARS-CoV-2 RBD. No está claro si la terapia con mAb puede impulsar la generación de nuevas variantes altamente transmisibles; nuestro estudio que utiliza la neutralización in vitro no da ninguna indicación de qué tan adecuadas serían estas variantes en la población general. También parece poco probable que el escape impulsado por mAb en el número extremadamente pequeño de pacientes que reciben terapia acelere notablemente la generación de nuevas variantes en comparación con lo que está sucediendo en la pandemia en general, con millones de infecciones que ocurren todos los días, en un cada vez más expuesto naturalmente o población vacunada, donde la presión de selección para el escape de anticuerpos ya es extrema. De hecho, la mayor parte de la presión de selección no está impulsada por la presión de los anticuerpos y ocurre en individuos no tratados a medida que el virus evoluciona durante transmisiones sucesivas, pero este proceso también puede conducir a la pérdida del potencial terapéutico de los anticuerpos. No obstante, el uso repetido y quizás inconsistente de la terapia con mAb en personas con infección crónica, que se ha documentado que albergan el virus durante meses y, en algunos casos, más de un año, debe controlarse de cerca, y se debe hacer hincapié en la adherencia al tratamiento. El potencial de mutación del virus no debería desanimarnos a implementar intervenciones clínicas como vacunas y tratamiento, ya que las intervenciones previenen infecciones graves y reducen el número total de casos, lo que hace que la aparición de una nueva variante sea menos probable. La Agencia de Seguridad Sanitaria del Reino Unido realiza regularmente el análisis de los conjuntos de datos de secuencias posteriores al tratamiento y la posible transmisión de mutaciones emergentes posteriores al tratamiento y se publica en línea (https://www.gov.uk/government/publications/covid-19-therapeutic -agents-technical-briefings) para detectar rápidamente mutaciones emergentes del tratamiento y reaccionar si es necesario.

Aunque nuestros resultados son convincentes, nuestro estudio adolece de varias limitaciones. Utilizamos ensayos de neutralización in vitro y podemos subestimar el potencial de neutralización de mAb in vivo, donde los efectos de la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos y el complemento pueden aumentar la actividad. Además, utilizando sistemas in vitro, no podemos determinar si las mutaciones de escape seleccionadas por la terapia con mAb serían aptas para competir con las variantes virales naturales en las infecciones naturales. No observamos datos de secuencias profundas para observar cambios en las frecuencias de variantes menores a lo largo del tiempo, nuestras secuencias son lecturas de consenso. Nuestro enfoque de un solo aminoácido puede pasar por alto mutaciones compensatorias que no resultan significativas en un análisis a gran escala, pero que pueden ser importantes en pacientes que ya han desarrollado una sustitución emergente del tratamiento. La investigación futura debería examinar la dinámica de la población de mutaciones virales dentro del paciente y usar análisis longitudinales para identificar variantes de baja frecuencia y estimar la fuerza de la selección. La vinculación con datos clínicos como la duración de la infección y las inmunodeficiencias crónicas ayudará a identificar los predictores de resistencia. Las cargas virales y los datos clínicos no estaban disponibles para nosotros. Este estudio no examinó las células T que contribuyen a la defensa del huésped y se ven menos afectadas por la mutación.

En resumen, aquí demostramos cambios mutacionales en virus aislados de pacientes tratados con mAb. Los perfiles mutacionales de los pacientes tratados con sotrovimab o REGEN-COV son notablemente diferentes y las mutaciones se asignan a los sitios de unión del mAb en Delta o BA.1 RBD. Las mutaciones correspondientes alteran la unión de los mAbs a RBD, lo que da como resultado un título de neutralización reducido. Sorprendentemente, para REGEN-COV, los virus desarrollan pares de mutaciones para escapar de ambos componentes del cóctel de anticuerpos.

La vigilancia de las pruebas y vacunas contra la enfermedad por coronavirus 2019 (Covid-19) se lleva a cabo de conformidad con la Regulación 3 de las Regulaciones del Servicio de Salud (Control de la información del paciente) de 2002 para recopilar información confidencial del paciente (www.legislation.gov.uk/uksi/2002/1438/ reglamento/3/hecho.se abre en una pestaña nueva) en las Secciones 3(i)(a–c), 3(i)(d) (i) y (ii), y 3. El protocolo de estudio de vigilancia genómica (https:/ /www.gov.uk/government/publications/covid-19-genomic-surveillance-of-patients-who-are-treat-with-neutralising-monoclonal-antibody-or-immunosuppressed) fue objeto de una revisión interna por parte de la UKHSA England Research Ethics and Governance Group y se encontró que cumplía totalmente con todos los requisitos reglamentarios. Dado que no se identificaron problemas normativos y que una revisión ética no es un requisito para este tipo de trabajo, se decidió que no sería necesaria una revisión ética completa. No obtuvimos el consentimiento informado ni proporcionamos ninguna compensación a los participantes.

En abril de 2020, el Reino Unido estableció un programa nacional de vigilancia genómica del SARS-CoV-2 a través del cual se han secuenciado de forma rutinaria los virus de una muestra aleatoria de población positiva en la comunidad y el hospital34. Además, se introdujo un protocolo para mejorar la cobertura de secuenciación de quienes reciben tratamiento en hospitales y dentro de la comunidad (incluido el muestreo previo al tratamiento y de seguimiento). Los pacientes en tratamiento fueron vinculados a sus secuencias genéticas a través de sus COG-ID. El presente análisis incluye a todos los pacientes que han recibido tratamiento en el Reino Unido, de los que se había recogido al menos una muestra antes del 12 de abril de 2022 y de los que se disponía de una secuencia genética viral. Debido a que los conjuntos de datos posteriores al tratamiento ya eran pequeños y debido a que no esperábamos diferencias por sexo en la evolución viral, no consideramos el sexo o el género en el diseño de nuestro estudio, y no vinculamos más la información del paciente para obtener la edad, el sexo o el género.

A esa fecha, las cinco intervenciones terapéuticas desplegadas en la población incluían casirivimab/imdevimab, sotrovimab, molnupiravir, remdesivir y paxlovid (nirmatrelvir más ritonavir). Para cada paciente, los datos disponibles incluyen: fecha de la muestra, intervención/tratamiento terapéutico y fecha del tratamiento.

La canalización utilizada para recopilar y procesar datos de secuencias de SARS-CoV-2 sin procesar y metadatos asociados a muestras en la red de vigilancia genómica del Reino Unido se ha descrito previamente35. Una red de sitios de muestreo (incluidos hospitales y centros de pruebas) produce muestras y metadatos de muestra. La mayoría de las muestras clínicas fueron frotis nasales/bucofaríngeos, pero también se recogieron muestras de aspirados nasofaríngeos, lavado broncoalveolar y esputo. Algunos sitios de muestreo realizaron su propia secuenciación; en caso contrario, se conectaron a un centro de secuenciación regional o al instituto Wellcome Sanger. Los centros regionales de secuenciación incluyen instituciones académicas, laboratorios y agencias de salud pública. Todas las secuencias analizadas en el presente manuscrito se generaron a través del pilar 1, lo que significa que se recolectaron en el NHS y se procesaron en el sitio de la muestra o por un laboratorio universitario para un cambio más rápido. El centro de secuenciación extrae y secuencia muestras. El procedimiento de secuenciación exacto varió entre los sitios, sin embargo, la mayoría de los sitios se adhirieron al protocolo ARTIC (https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing-protocol-v3-locost-bp2l6n26rgqe/v3), usando ya sea Illumina o la plataforma Oxford Nanopore Technologies. La tubería de bioinformática ARTIC (https://github.com/connor-lab/ncov2019-artic-nf) luego convierte los datos de secuenciación del SARS-CoV-2 en secuencias de consenso y una alineación de fragmentos de lectura de secuencia alineados con el SARS-CoV-2 genoma de referencia (NCBI NC_045512.2). Los linajes de COVID se asignaron utilizando Pango v1.336.

Todas las secuencias de pacientes que se sabe que se han sometido a tratamiento se descargaron de CLIMB. Las alineaciones del genoma se dividieron en regiones de genes (spike, nsp5, nsp7, nsp8, nsp9, nsp10, nsp12, nsp14) y se tradujeron a aminoácidos para su análisis. Se realizaron análisis para cada tratamiento sobre las proteínas con las que se teoriza que interactúan. Los análisis se dividieron por variante (Delta, Omicron BA.1 y Omicron BA.2), con sublinajes Delta (B.1617.2 y todos los linajes AY) todos clasificados como Delta. Como tal, cada análisis se realizó de forma independiente en cada combinación de tratamiento, variante y región genética de interés (Tabla S1).

Las secuencias de pretratamiento son aquellas obtenidas de pacientes con una muestra secuenciada dentro de una semana antes del inicio del tratamiento (incluido el día de inicio del tratamiento). El análisis se repitió con un rango de puntos de corte para definir las secuencias posteriores al tratamiento, incluidas las secuencias posteriores al tratamiento solo si se tomaron muestras al menos 1, 5, 10 o 14 días después del tratamiento. Nuestro análisis principal utiliza el límite de 10 días, y se presentan 1, 5 y 14 días como análisis de sensibilidad. Para cada análisis, dividimos el conjunto de datos en secuencias previas y posteriores al tratamiento. En cada sitio del alineamiento, se calculó la frecuencia de aminoácidos en secuencias antes y después del tratamiento, y se usó la prueba exacta de Fisher para determinar si esta distribución de probabilidad divergía de la expectativa nula. De esta forma, se identificaron los sitios que muestran diferencias inesperadas en las frecuencias de aminoácidos y se destacaron los cambios de aminoácidos específicos. Los análisis se realizaron a nivel de paciente en lugar de a nivel de secuencia, de modo que si un paciente tenía múltiples secuencias previas o posteriores al tratamiento, se retenía una sola secuencia, favoreciendo las secuencias divergentes del tipo salvaje.

Todas las secuencias de Delta (n = 763 511), BA.1 (n = 742 992) y BA.2 (n = 407 161) desde septiembre de 2021 en adelante se descargaron de CLIMB, se tradujeron a aminoácidos y se dividieron en proteínas utilizando un script interno. Para cada sitio de aminoácido identificado en nuestro análisis, las frecuencias de aminoácidos se tabularon y calcularon como proporciones del número total de secuencias con un aminoácido legible.

Los modelos estructurales de los complejos RBD-mAbs se generaron por superposición de 7ORB [https://www.rcsb.org/structure/7ORB] (RBD con L452R) y Omicron RBD (7TLY [https://www.rcsb.org/structure /7TLY]) con complejos de RBD-casirivimab/imdevimab (6XDG [https://www.rcsb.org/structure/6XDG]) y RBD-sotrovimab (7BEP [https://www.rcsb.org/structure/7BEP ]) respectivamente, utilizando el programa SHP37 para alinear los dominios RBD. Los modelos de 7ORB [https://www.rcsb.org/structure/7ORB] RBD acoplados con casirivimab/imdevimab y Omicron RBD acoplados con sotrovimab se extrajeron y analizaron en los sitios de interacción farmacológica utilizando Coot38. Las imágenes de gráficos moleculares se generaron usando UCSF ChimeraX39.

El suero vacunal de Pfizer se obtuvo de voluntarios que habían recibido tres dosis de la vacuna BNT162b2 (Pfizer/BioNTech). Los vacunados eran trabajadores de la salud, con sede en Oxford University Hospitals NHS Foundation Trust, sin antecedentes de infección por SARS-CoV-2 y se inscribieron en el estudio OPTIC como parte del estudio 16/YH/0247 del Biobanco GI de la Unidad Gastrointestinal de Oxford. [comité de ética de la investigación (REC) en Yorkshire & The Humber – Sheffield] que se modificó para este propósito el 8 de junio de 2020. El estudio se realizó de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki (2008) y la Conferencia Internacional sobre Armonización ( ICH) Directrices de Buenas Prácticas Clínicas (BPC). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes inscritos en el estudio. Se tomaron muestras de los participantes aproximadamente 28 días (mediana 31, rango 28–56), después de recibir una tercera dosis de refuerzo de la vacuna de ARNm BNT162b2 de Pfizer/BioNtech, 30 microgramos, administrados por vía intramuscular después de la dilución (0,3 ml cada uno), con 17–28 días de diferencia entre dosis 1 y 2, luego ~9 meses de diferencia (rango 253–300) para las dosis 2 y 3. La edad media de los vacunados fue de 42 años (rango 30–59), 10 hombres y 9 mujeres.

Se construyeron lentivirus pseudotipados que expresan proteínas de pico de SARS-CoV-2 para cepas ancestrales (Victoria, Delta y BA.1) como se describió antes29,40 con algunas modificaciones. Se aplicó una estrategia similar para todas las construcciones variantes. Delta y BA.1 se usaron como plantilla y las construcciones se clonaron mediante amplificación por PCR del vector y los insertos, seguido de ensamblaje Gibson. Para generar los fragmentos de inserción, los cebadores superpuestos para todas las variantes individuales se usaron por separado para amplificar, junto con dos cebadores del vector pcDNA3.1 (pcDNA3.1_BamHI_F y pcDNA3.1_Tag_S_EcoRI_R). El vector pcDNA3.1 también se amplificó utilizando los cebadores pcDNA3.1_Tag_S_EcoRI_F y pcDNA3.1_BamHI_R. Los pares de cebadores utilizados en este estudio se muestran en el suplemento (Tabla S2). Todas las construcciones se verificaron mediante secuenciación de Sanger después del aislamiento del plásmido utilizando el kit QIAGEN Miniprep (QIAGEN). El pcDNA3.1 portador del gen de pico resultante se usó para generar partículas pseudovirales junto con el vector de empaquetamiento lentiviral y el vector de transferencia que codifica el indicador de luciferasa.

Los detalles de la prueba de neutralización pseudoviral se describieron previamente19,40 con algunas modificaciones. Brevemente, se incubó una dilución en serie cuádruple de cada mAb, a partir de 10 µg/ml, con partículas pseudovirales a 37 °C, CO2 al 5 % durante 1 hora. A continuación, se añadieron a la mezcla las células estables HEK293T/17 (ATCC, CRL-11268) que expresan ACE2 humana a razón de 1,5 × 104 células/pocillo. A las 48 h después de la transducción, se retiraron los sobrenadantes del cultivo y se agregaron 50 µL del sistema de ensayo de luciferasa Bright-GloTM 1:2 (Promega, EE. UU.) en PBS 1x a cada pocillo. La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 5 min y la actividad de luciferasa de luciérnaga se midió usando CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Alemania). El porcentaje de neutralización se calculó con respecto al control. Se utilizó el análisis probit para estimar el valor de la dilución que inhibe la mitad de la infección máxima por lentivirus pseudotipado (PVNT50). Los anticuerpos incluidos en el estudio fueron Imdevimab (Regeneron), Casirivimab (Regeneron) y Sotrovimab (GSK). Para determinar la actividad neutralizante de los sueros vacunales, se incubaron diluciones en serie de 3 veces a partir de muestras puras con partículas pseudovirales durante 1 hora y se aplicó la misma estrategia que el mAb. Las secuencias de cebadores utilizadas para generar pseudovirus se enumeran en la Tabla S2.

Para generar la construcción de RBD marcada con His, se realizó mutagénesis por PCR dirigida al sitio utilizando la construcción de plásmido de pseudovirus Delta o BA.1 como plantilla, o la construcción de plásmido de pseudovirus que contenía el mutante de RBD deseado se utilizó como plantilla para la amplificación de RBD. fragmento de gen.

La plantilla, los cebadores y los vectores de expresión utilizados para la clonación de cada RBD se muestran en la Tabla S3 y las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla S4.

La clonación se realizó utilizando el kit de clonación ClonExpress II One Step (Vazyme). Las construcciones se verificaron mediante secuenciación de Sanger después del aislamiento del plásmido utilizando el kit QIAGEN Miniprep (QIAGEN).

Los plásmidos que codifican RBD se transfectaron en células Expi293F™ (Gibco, A14527) mediante PEI, se cultivaron en medio de expresión FreeStyle™ 293 (ThermoFisher) a 30 °C con 8 % de CO2 durante 3 días. El medio acondicionado se diluyó 1:2 en tampón de unión (fosfato sódico 50 mM, cloruro sódico 500 mM, pH 8,0). Los RBD se purificaron con una columna de níquel HisTrap de 5 ml (GE Healthcare) a través de la unión de etiqueta His, seguida de una columna de filtración en gel Superdex 75 10/300 GL (GE Healthcare) en HEPES 10 mM y cloruro de sodio 150 mM.

Los experimentos de resonancia de plasmones superficiales se realizaron utilizando un Biacore T200 (GE Healthcare). Todos los ensayos se realizaron con un tampón de funcionamiento de HBS-EP (Cytiva) a 25 °C. Se utilizó un chip sensor de Proteína A (Cytiva). El mAb como se indica se inmovilizó en la celda de flujo de muestra del chip sensor. La celda de flujo de referencia se dejó en blanco.

Para determinar la cinética de unión, se inyectó RBD sobre las dos celdas de flujo en un rango de cinco concentraciones preparadas mediante diluciones dobles en serie, a una velocidad de flujo de 30 μl min-1 utilizando un programa de cinética de ciclo único. El búfer de ejecución también se inyectó usando el mismo programa para la sustracción de fondo. Todos los datos se ajustaron a un modelo de unión 1:1 utilizando el software de evaluación Biacore T200 3.1. Para determinar la afinidad de unión (donde la cinética era difícil de determinar), se inyectó RBD sobre las dos celdas de flujo en un rango de concentraciones preparadas por diluciones dobles en serie, a una velocidad de flujo de 30 μl min−1. El búfer de ejecución también se inyectó usando el mismo programa para la sustracción de fondo. Todos los datos de KD se ajustaron a un modelo de enlace 1:1 utilizando el software de evaluación Biacore T200 3.1; las figuras se trazaron con GraphPad Prism 9.

Para comparar los perfiles de unión entre Delta RBD + G446V / Delta RBD + G446V + Y453F/Delta RBD + G446V + L455F y Delta RBD WT para imdevimab, se realizó una única inyección de RBD en las dos celdas de flujo a 1 μM, a un flujo velocidad de 30 μl min−1. El búfer de ejecución también se inyectó usando el mismo programa para la sustracción de fondo. Los sensogramas se trazaron utilizando Prism9 (GraphPad).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los reactivos generados en este estudio están disponibles en David Stuart con un Acuerdo de transferencia de materiales completado. Los datos genómicos del SARS-CoV-2 generados en este estudio se han depositado en Genbank. La lista de ID se proporciona en Datos complementarios 1. Los datos de origen para todas las figuras se proporcionan como un archivo de datos de origen. La información sobre tratamientos clínicos a nivel individual, vinculada a la identificación de secuencia, tiene acceso restringido por razones de confidencialidad del paciente, pero las personas pueden obtener acceso mediante la presentación de una propuesta de investigación razonable enviada a Meera Chand [email protected] y firma de un acuerdo de intercambio de datos.

El análisis se realizó a través de una serie de scripts disponibles en github (https://github.com/manonr/covid-therapeutics). Un enlace permanente a la versión del código utilizado en este estudio está disponible en https://github.com/manonr/covid-therapeutics/releases/tag/v.1.0-2023-01.

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Agradecemos a Andrew Balmer por examinar las lecturas sin procesar para confirmar el vínculo entre las mutaciones, y a todo el equipo de análisis de salud pública de genómica y el programa terapéutico COVID-19, en la Agencia de Seguridad Sanitaria del Reino Unido. Agradecemos a todos los equipos involucrados en el muestreo, secuenciación y procesamiento de virus y secuencias del SARS-CoV-2. Agradecemos a todos los voluntarios que donaron sangre para el estudio. Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Innovación para Ciencias Médicas (CIFMS) de la Academia China de Ciencias Médicas (CAMS), China (número de subvención: 2018-I2M-2-002) a DIS y GRS. También estamos agradecidos por el apoyo de Red Avenue. Fundación y la Fundación Oak. GRS y J.Ren cuentan con el apoyo de Wellcome Trust (101122/Z/13/Z), DIS y EEF de UKRI MRC (MR/N00065X/1). DIS, SJD y GRS son investigadores de Jenner. PK es un investigador sénior de NIHR y PK cuenta con el respaldo de Wellcome (WT109965MA). SJD cuenta con el apoyo de una Cátedra de Investigación Global NIHR (NIHR300791) Este trabajo también fue apoyado por el Departamento de Salud y Atención Social del Reino Unido como parte del Consorcio PITCH (Protective Immunity from T cells to Covid-19 in Health Workers) y UKRI ( MR/W02067X/1), con contribuciones de UKRI/NIHR a través del Consorcio de Inmunología del Coronavirus del Reino Unido (UK-CIC), la Fundación de la Familia Huo y el Instituto Nacional de Investigación en Salud (UKRIDHSC COVID-19 Rapid Response Rolling Call, Grant Reference Number COV19 -RECPLAS). Agradecemos al personal de la Unidad de Inmunología Humana de MRC por acceder a su Instalación Biacore. Reconocemos la financiación conjunta del Centro por parte del Consejo de Investigación Médica y el Departamento para el Desarrollo Internacional del Reino Unido (MR/R015600/1). Este trabajo también cuenta con el apoyo del Instituto Nacional de Investigación en Salud, Unidad de Investigación de Protección de la Salud en Metodología de Modelado, la Fundación Abdul Latif Jameel y el programa EDCTP2 respaldado por la Unión Europea.

Estos autores contribuyeron por igual: Manon Ragonnet-Cronin, Rungtiwa Nutalai, Jiandong Huo, Aiste Dijokaite-Guraliuc, Gavin R. Screaton, Sakib Rokadiya.

Análisis de salud pública de genómica, Agencia de Seguridad Sanitaria del Reino Unido, Londres, Reino Unido

Manon Ragonnet-Cronin, Natalie Groves, Hassan Hartman, Nicholas Ellaby, J. Mark Sutton, Colin Brown, Susan Hopkins, Meera Chand y Sakib Rokadiya

Centro para el Análisis Global de Enfermedades Infecciosas, Imperial College London, Londres, Inglaterra

Por Manon Ragonnet-Cron

Centro Wellcome de Genética Humana, Departamento de Medicina de Nuffield, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Rungtiwa Nutalai, Aiste Dijokaite-Guraliuc, Raksha Das, Aekkachai Tuekprakhon, Piyada Supasa, Chang Liu, Muneeswaran Selvaraj, Juthathip Mongkolsapaya y Gavin R. Screaton

División de Biología Estructural, Departamento de Medicina de Nuffield, Universidad de Oxford, Centro Wellcome de Genética Humana, Oxford, Reino Unido

Jiandong Huo, Mohammad W. Bahar, Daming Zhou, Elizabeth Fry, Jingshan Ren y David I. Stuart

Academia China de Ciencias Médicas (CAMS) Instituto Oxford (COI), Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Chang Liu y Daming Zhou

Departamento de Medicina de Nuffield, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Paul Klenerman y Susanna J. Dunachie

Fideicomiso de la Fundación NHS de los Hospitales de la Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Paul Klenerman y Susanna J. Dunachie

Unidad de Gastroenterología Traslacional, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Pablo Klenerman

NIHR Oxford Biomedical Research Centre, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Paul Klenerman y Susanna J. Dunachie

Unidad de Investigación de Medicina Tropical Mahidol-Oxford, Bangkok, Tailandia, Departamento de Medicina, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Juthathip Mongkolsapaya

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MRC, SR, GRS y DIS concibe el estudio. MRC realizó los análisis posteriores al tratamiento. NG realizó los análisis de vigilancia genómica del Reino Unido. RN, AD-G., RD, AT, PS, CL, MS, DZ y JH realizaron experimentos, JH, JM, MC diseñaron experimentos, PK y SJD supervisaron el estudio OPTIC para la recolección de suero vacunal, como parte del PITCH consorcio. MB, JR, EF y DIS realizaron análisis de estructura. NG, HH, NE, MS, CB, SH y SR analizaron datos de secuencia. MRC, GRS, JH y DIS escribieron el primer borrador del manuscrito. Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia con Manon Ragonnet-Cronin, Jiandong Huo, David I. Stuart, Gavin R. Screaton o Sakib Rokadiya.

GRS forma parte del Consejo Asesor Científico de Vacunas de GSK, asesora a Astra Zeneca y es miembro fundador de RQ Biotechnology. DIS consulta por Astra Zeneca. Los autores restantes declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature Communications agradece a Anmol Chandele y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Ragonnet-Cronin, M., Nutalai, R., Huo, J. et al. Generación de mutaciones de escape de SARS-CoV-2 mediante terapia con anticuerpos monoclonales. Nat Comun 14, 3334 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37826-w

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Recibido: 06 Octubre 2022

Aceptado: 03 abril 2023

Publicado: 07 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37826-w

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