genoma

Sep 15, 2023

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 7962 (2022) Citar este artículo

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La actividad d,d-transpeptidasa de las proteínas de unión a penicilina (PBP) es el objetivo principal bien conocido de los antibióticos β-lactámicos que bloquean la polimerización de peptidoglicano. La muerte bacteriana inducida por β-lactámicos implica respuestas complejas aguas abajo cuyas causas y consecuencias son difíciles de resolver. Aquí, usamos el reemplazo funcional de PBP por una l, d-transpeptidasa insensible a β-lactámicos para identificar genes esenciales para mitigar los efectos de la inactivación de PBP por β-lactámicos en bacterias que se dividen activamente. Las funciones de los 179 genes condicionalmente esenciales identificados por este enfoque se extienden mucho más allá de los socios de la l,d-transpeptidasa para la polimerización de peptidoglicano para incluir proteínas involucradas en la respuesta al estrés y en el ensamblaje de polímeros de membrana externa. Los efectos inesperados de los β-lactámicos incluyen la pérdida del enlace covalente mediado por lipoproteínas que une la membrana externa al peptidoglucano, la desestabilización de la envoltura celular a pesar del entrecruzamiento eficaz del peptidoglucano y el aumento de la permeabilidad de la membrana externa. Este último efecto indica que el modo de acción de los β-lactámicos involucra la penetración autopromovida a través de la membrana externa.

Las bacterias gramnegativas, como Escherichia coli, poseen una envoltura multicapa que sostiene la presión de turgencia del citoplasma (peptidoglucano de la pared celular) y actúa como una barrera química selectiva para nutrientes, desechos y compuestos tóxicos (membranas internas y externas) (Fig. .1a)1. Varios polímeros que contienen fracciones de proteínas, péptidos, glicanos y lípidos aseguran las propiedades mecánicas y las funciones de transporte de la envoltura. El peptidoglucano (PG), que está unido covalentemente a la membrana externa a través de la lipoproteína de Braun, es una macromolécula similar a una red gigante (aprox. 109 Da) polimerizada a partir de una unidad de disacárido-pentapéptido (Fig. 1b). Las glicosiltransferasas catalizan la formación de enlaces glucosídicos β-1,4 entre disacáridos para formar cadenas de glucano que posteriormente se entrecruzan entre sí mediante transpeptidasas (Fig. 1c). Las últimas enzimas, las d,d-transpeptidasas, también se conocen como proteínas de unión a penicilina (PBP), ya que son los objetivos esenciales de los antibióticos β-lactámicos. Para la polimerización de peptidoglicano, las PBP interactúan con el extremo d-Ala4-d-Ala5 de un tallo de pentapéptido (de ahí la designación d,d) y forman un enlace covalente entre d-Ala4 y su residuo Ser del sitio activo con la liberación concomitante de d -Ala5. En el siguiente paso, la acil-enzima resultante reacciona con el segundo sustrato, con mayor frecuencia un tallo tetrapeptídico, para formar un dímero Tetra-Tetra reticulado 4 → 3 con la liberación concomitante de la PBP (Fig. 1c; Fig. Suplementaria. S1a)2. En cooperación con proteínas de andamiaje y endopeptidasas, las d,d-transpeptidasas median la inserción de hebras de glicano en la macromolécula similar a una red PG en expansión, determinando así la forma bacteriana y asegurando una barrera mecánica contra la presión osmótica del citoplasma durante toda la célula. ciclo3,4,5,6,7.

a La envoltura está compuesta por membranas internas (IM, gris) y externas (OM, negras). El peptidoglicano (PG, azul) asegura la protección osmótica de la célula bacteriana. La MI es una bicapa lipídica compuesta principalmente por fosfolípidos (PL). La MO es una bicapa lipídica asimétrica: la valva interior está compuesta por PL y la valva exterior por lipopolisacáridos (LPS) y fosfatidilglicéridos sustituidos por el antígeno común de enterobacterias (ECAPGL). b Estructura de la subunidad PG (GlcNAc, N-acetil-glucosamina; MurNAc, ácido N-acetil-murámico). c PG es una macromolécula en forma de red hecha de cadenas de glicano (polígonos azul-púrpura) entrecruzadas entre sí por tallos peptídicos cortos (círculos de colores). Las PBP catalizan la formación de 4 → 3 enlaces cruzados que conectan la cuarta posición de un vástago donador de acilo con la tercera posición del aceptor. Dos miembros de la familia LDT (YcbB y YnhG) catalizan la formación de 3 → 3 enlaces cruzados. Tres LDT (ErfK, YbiS e YcfS) anclan la lipoproteína de Braun (Lpp) al PG. La unión de DAP en la tercera posición de un vástago donante de PG al extremo Arg-Lys de la Lpp proporciona un enlace covalente entre el OM y el PG. El enlace PG-Lpp es hidrolizado por el YafK LDT46,47. d Perfil de rpHPLC de muropéptidos de la cepa BW25113(ycbB, relA') cultivada sin ceftriaxona. La estructura se deduce de los fragmentos obtenidos por digestión de PG con muramidasas que escinden el enlace MurNAc-GlcNAc β-1,4. e Estructura de los muropéptidos deducida a partir de análisis de espectrometría de masas. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La omisión de la actividad d,d-transpeptidasa de las PBP por parte de las l,d-transpeptidasas (LDT) estructuralmente no relacionadas genera resistencia a la mayoría de los β-lactámicos8,9. Las l, d-transpeptidasas escinden el enlace peptídico l, d mesoDAP3-d-Ala4 de los tallos tetrapeptídicos y forman 3 → 3 enlaces cruzados (Fig. 1c; Fig. complementaria S1b) 10. Otros miembros de la familia de las l,d-transpeptidasas son responsables del anclaje de la lipoproteína de Braun al PG (Fig. S1c complementaria)11. La activación de la ruta de polimerización de PG de la l,d-transpeptidasa, en su mayoría críptica, se descubrió por primera vez en mutantes resistentes a los β-lactámicos de Enterococcus faecium seleccionados in vitro12,13. La transpeptidación de l,d es el modo principal de entrecruzamiento de PG en Mycobacterium tuberculosis patógeno14 y puede ser el objetivo de quimioterapias de tercera línea basadas en el meropenem β-lactámico15. En E. coli, la activación de la vía requiere una sobreproducción tanto de YcbB l,d-transpeptidasa (LdtD) como de guanosina penta- o tetrafosfato (p)ppGpp alarmone8. Posteriormente, se informó que YcbB participaba en el mantenimiento de PG, ya que compensaba los defectos en la exportación de lipopolisacáridos16.

La actividad d,d-transpeptidasa de las PBP se identificó como el objetivo principal de los β-lactámicos en la década de 196017. Sin embargo, descifrar la cascada de eventos aguas abajo que conduce a la muerte bacteriana plantea desafíos particulares18,19,20,21. Este tema sigue siendo objeto de intensas investigaciones.

En este trabajo, investigamos las funciones que son esenciales para el rescate de la actividad de entrecruzamiento 4 → 3 inactivada por β-lactámicos de las PBP por la actividad de entrecruzamiento 3 → 3 de la l,d-transpeptidasa YcbB a escala del genoma . Los resultados se basan en la identificación Tn-seq de genes esenciales para la resistencia a los β-lactámicos mediada por YcbB, la construcción de múltiples eliminaciones de genes para descifrar las relaciones epistáticas y la determinación de la estructura de PG por espectrometría de masas (Fig. 1d, e). Este análisis abre una nueva ventana sobre la capacidad de evolución de la envoltura celular, sobre la compleja red de interacciones que atañen a la homeostasis de los polímeros de la envoltura y sobre los mecanismos que desarrolla E. coli para luchar contra el estrés inducido por la acción mediada por β-lactámicos. Inactivación de la d,d-transpeptidasa.

Se utilizó un enfoque de secuenciación de transposones (Tn-seq)22 para identificar genes esenciales para la resistencia a β-lactámicos mediada por YcbB en el genoma de E. coli BW25113(ycbB, relA')8. Esta cepa combina un alto nivel de producción de l,d-transpeptidasa YcbB y de (p)ppGpp sintetasa RelA' tras la inducción por IPTG y l-arabinosa de los genes ycbB y relA', respectivamente. Se compararon dos condiciones experimentales, ausencia (−CRO) o presencia (+CRO) de ceftriaxona. El β-lactámico ceftriaxona fue elegido para nuestro análisis ya que esta cefalosporina de 3ra generación de amplio espectro es altamente efectiva para inactivar todas las d,d-transpeptidasas pertenecientes a la familia PBP y es específica de estas enzimas ya que las l,d-transpeptidasas no se inactivan debido a una combinación de acilación ineficaz y formación de una acil-enzima propensa a la hidrólisis23,24. Para ambas condiciones, se añadieron IPTG y l-arabinosa para inducir los genes que codifican la l,d-transpeptidasa YcbB y la sintasa RelA' (p)ppGpp, respectivamente. La extracción de ADN genómico se realizó en grupos de 810 000 (−CRO) y 260 000 (+CRO) transformantes y se secuenció. Los duplicados técnicos de extracciones de ADN independientes revelaron coeficientes de correlación R2 de 0,90 y 0,94 para las condiciones −CRO y +CRO, respectivamente (Fig. 2a, b). Las secuencias que contienen uniones se alinearon con el genoma de referencia de E. coli BW25113 y los genes esenciales se identificaron mediante la cuantificación de la presencia de espacios en las inserciones (Fig. 2c). Se compararon los números promedio de lecturas por gen para identificar genes en los que las inserciones de transposones estaban significativamente subrepresentadas (valor p <0.05) en la condición + CRO (Fig. 2d; Archivo de datos complementarios 1a).

a, b Correlación de números de lectura promedio normalizados por CDS para dos réplicas técnicas secuenciadas obtenidas para las condiciones −CRO y +CRO, respectivamente. c Frecuencia y ubicación de las inserciones de transposones. Los anillos, de más externo a más interno, corresponden a: (i) las coordenadas BW25113; (ii) los CDS sentido (gris claro) y antisentido (gris); (iii) el log2 del cambio de veces de inserción para las condiciones −CRO frente a +CRO. Los datos para proporciones de −CRO a +CRO menores y mayores que 1 aparecen en amarillo y morado, respectivamente; y (iv) los CDS sentido y antisentido específicamente esenciales en la condición +CRO, respectivamente. d El gráfico del volcán representa los genes para los que la inactivación del transposón es beneficiosa o perjudicial en la condición +CRO. El eje X representa el log2 del cambio de pliegue de las lecturas promedio por gen para las condiciones −CRO frente a +CRO. El eje Y representa el log10 negativo del valor p obtenido de la prueba t de dos colas no apareadas. El área rosa corresponde a genes con un número de inserciones al menos 4 veces menor en la condición +CRO con un valor de p < 0,05. e Funciones biológicas de genes específicamente esenciales en la condición +CRO. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Los análisis Tn-seq revelaron que entre los 4309 CDS anotados, 179 eran selectivamente esenciales en la condición +CRO de acuerdo con una combinación estricta de tres criterios que incluyen (i) la presencia de una brecha en las inserciones de transposones, (ii) una p- valor (<0.05), y (iii) un cambio de pliegue mayor que 4 (ver "Métodos") (Archivo de datos complementarios 1b). No se encontró ningún gen que fuera selectivamente esencial en la condición −CRO. Los genes selectivamente esenciales 179 + CRO se asignaron a siete categorías funcionales y se encontró que la mayoría está involucrada en el metabolismo de los componentes de la envoltura (N = 71, 40%) y en las respuestas al estrés (N = 35, 20%) (Fig. 2e ). Los perfiles Tn-seq relevantes de los genes discutidos en este estudio se compilaron en el archivo de datos complementarios 2.

La síntesis del tabique está mediada por componentes del divisoma que se reclutan en la mitad de la célula mediante el ensamblaje del anillo FtsZ (Fig. 3a)6. Las proteínas del divisoma central, FtsA, FtsEX, FtsQLB, FtsW, FtsZ, ZipA y PBP3, fueron esenciales tanto en las condiciones −CRO como +CRO. Por el contrario, las proteínas asociadas a divisomas implicadas en el control del ciclo celular (MinCD, FtsK)25,26, en la estabilización del divisoma en condiciones de estrés (FtsP)27,28,29 y en proporcionar un vínculo físico con el la membrana externa (TolABQR y Pal)30 solo fueron esenciales en la condición +CRO (Archivo de datos complementarios 1b; Archivo de datos complementarios 2).

a, b Representación esquemática del divisoma y elongasoma, respectivamente. c Perfiles de inserción Tn-seq de genes que codifican componentes del elongasoma. Los marcos de lectura se indican en la parte inferior del panel y están codificados por colores: rojo, genes selectivamente esenciales para +CRO; verde, genes esenciales tanto para −CRO como para +CRO; gris, genes no esenciales en ninguna de las dos condiciones. Los sitios de inserción de transposones están indicados por líneas sobre los marcos de lectura con su altura reflejando el número de lecturas para cada inserción. d Esencialidad de los genes que codifican los componentes de elongasoma PBP2 y RodA probados mediante mutagénesis dirigida al sitio. La eficacia de las placas se probó en presencia de ceftriaxona a 8 µg/ml (+ceftriaxona) o sin fármaco (−ceftriaxona) en placas de agar BHI suplementadas con IPTG 40 µM y L-arabinosa al 1 % para la inducción de ycbB y relA', respectivamente. Las placas se incubaron a 28 °C ya que las cepas que albergaban mrdA S330A y mrdA S330C no crecieron en presencia de ceftriaxona a 37 °C.

La expansión de la pared lateral del peptidoglicano está mediada por el elongasoma (Fig. 3b), que incluye (i) RodA, una glicosiltransferasa que pertenece a la familia de proteínas de forma, elongación, división y esporulación (SEDS), (ii) PBP2, una PBP de clase B catalíticamente monofuncional con actividad d,d-transpeptidasa, y (iii) MreB, una proteína similar a la actina que forma un citoesqueleto de andamiaje para el complejo de elongasoma6.

Análisis previos establecieron que el elongasoma es prescindible para el crecimiento en mutantes que sobreproducen la alarmona (p)ppGpp31,32. Como era de esperar, el análisis Tn-seq indicó que cada uno de los seis genes de elongasoma (mrdA, rodA, rodZ, mreB, mreC y mreD) eran prescindibles para el crecimiento en la condición −CRO, que incluía l-arabinosa para la producción de (p) ppGpp por RelA' (Fig. 3c). El crecimiento de los mutantes de elongasoma dependía además de la expresión del gen de la sintasa relA' (p) ppGpp (Figura complementaria S2a). Sorprendentemente, los seis genes de elongasoma eran esenciales en la condición + CRO a pesar de la producción de (p) ppGpp (Fig. 3c). La esencialidad de PBP2 (codificada por mrdA) fue inesperada dado que esta PBP no podía participar directamente en el entrecruzamiento de PG debido a la inactivación de su dominio d,d-transpeptidasa por ceftriaxona8,33. Los componentes del elongasoma están codificados por grupos de genes compactos que son muy sensibles a los efectos polares que alteran potencialmente los niveles de transcripción de los genes adyacentes. Por lo tanto, complementamos nuestros resultados de Tn-seq utilizando un enfoque CRISPR-Cas9 (Fig. S2b complementaria) para la mutagénesis dirigida al sitio de mrdA en un solo paso para afectar la actividad transpeptidasa de PBP2. La expresión de resistencia a la ceftriaxona se eliminó mediante la eliminación de mrdA, pero no mediante el reemplazo del residuo catalítico Ser de la d, d-transpeptidasa por Ala o Cys (Fig. 3d; Fig. S2c complementaria). Por lo tanto, PBP2, pero no su actividad transpeptidasa, fue esencial para la resistencia a los fármacos.

Un enfoque similar de CRISPR-Cas9, aplicado a la mutagénesis del gen rodA de la glicosiltransferasa, reveló que se requería una forma catalíticamente activa de la glicosiltransferasa para el crecimiento en presencia de ceftriaxona (Fig. 3d; Fig. complementaria S2c). Anteriormente se demostró que PBP2, RodZ, MreB, MreC y MreD son esenciales para el ensamblaje del elongasoma, y ​​que la interacción entre PBP2 y RodA no depende de la actividad de PBP234,35,36. Por lo tanto, el entrecruzamiento de PG por YcbB requería la polimerización de las cadenas de glicano por RodA en un elongasoma funcional que contenía tanto RodA como PBP2, siendo prescindible la actividad transpeptidasa de la última enzima.

En E. coli, el 40-50 % del PG se degrada por generación con > 90 % de los muropéptidos resultantes reciclados por la célula37,38. Esto implica el transporte retrógrado de fragmentos de PG al citoplasma mediante permeasas especializadas, AmpG y el complejo Opp, seguido del reciclaje de los restos de azúcar y péptido como glucosamina y tripéptido l-Ala-γ-d-Glu-DAP, respectivamente (Fig. 4a). El análisis Tn-seq mostró que los genes que codifican la permeasa AmpG y cada componente del complejo Opp eran completamente prescindibles para el crecimiento tanto en condiciones de -CRO como de +CRO. Además, demostramos que el reciclaje de PG era totalmente prescindible mediante la construcción de un mutante triple ΔampG ΔoppF ΔmppA que resultó ser viable y resistente a la ceftriaxona a pesar de la pérdida de ambos transportadores (Fig. S3a complementaria). Sin embargo, la l, d-carboxipeptidasa LdcA citoplásmica fue esencial en la condición +CRO pero no en la -CRO (Archivo de datos complementarios 1b; Archivo de datos complementarios 2). Se demostró previamente que esta enzima recorta d-Ala4 de tallos tetrapeptídicos reciclados para proporcionar el tripéptido l-Ala-γ-d-Glu-DAP que se agrega directamente a UDP-MurNAc mediante la ligasa Mpl39,40. Se informó que la interrupción del gen que codifica LdcA da como resultado bacteriólisis durante el crecimiento estacionario, atribuido a una disminución drástica de la reticulación, ya que los tallos de tetrapéptidos reciclados no pueden servir como donantes de acilo por d,d-transpeptidasas (Fig. S1 complementaria)40. La misma explicación no puede dar cuenta del papel esencial de LdcA en la resistencia a ceftriaxona, ya que YcbB utiliza tallos de tetrapéptidos como donantes de acilo8. No obstante, el papel esencial de LdcA en la condición +CRO provino de la eliminación de tetrapéptidos importados ya que la eliminación del gen mpl restauró el crecimiento del mutante ΔldcA en presencia de ceftriaxona (Fig. S3a complementaria). La sobreexpresión de murA, que codifica la enzima que cataliza el primer paso comprometido de la síntesis de PG (Fig. 4a), también restauró la resistencia del mutante ΔldcA (Fig. S3b complementaria). Por lo tanto, impulsar el flujo metabólico a través de la vía de ensamblaje de PG compensa la toxicidad de los tetrapéptidos importados. Juntos, estos resultados indican que Mpl liga el tetrapéptido en UDP-MurNAc y que, en ausencia de LdcA, los precursores que contienen el tetrapéptido resultante se usan de manera ineficaz en los pasos posteriores de síntesis de PG y perjudican la eficacia global de la vía.

a La subunidad PG se ensambla mediante síntesis de novo (izquierda) y reciclaje de fragmentos de PG (derecha). b Síntesis de precursores de azúcar de nucleótidos de ácido colánico. c Ensamblaje de la subunidad de ácido colánico unida al transportador lipídico de undecaprenilo. d Polimerización y transporte de ácido colánico a la superficie celular. Abreviaturas: Ac acetilo; portador de lípidos de undecaprenilo C55; membrana interna IM; membrana externa de OM; fosfato de P; Pir piruvato.

Se informó que DapF, que convierte l,l-DAP en mesoDAP, es prescindible para el crecimiento en E. coli41. La ligasa MurE cataliza la adición de l,l-DAP a UDP-MurNAc-l-Ala-d-Glu, aunque con menos eficacia que la adición de mesoDAP debido a una diferencia de 3000 veces en Km41. La eliminación del gen que codifica DapF da como resultado la incorporación de l,l-DAP en precursores de peptidoglicano. Los péptidos madre que contienen l,l-DAP fueron utilizados de manera ineficaz como donantes de acilo por las PBP, pero no como aceptores41. El entrecruzamiento general de peptidoglicano se redujo moderadamente41. En concordancia, l,l-DAP fue fuertemente discriminado contra mesoDAP por PBP1b purificada in vitro42. En nuestro estudio, dapF no fue esencial en la condición −CRO. Por el contrario, no se encontraron inserciones de transposones en este gen en la condición + CRO (Archivo de datos complementarios 1b; Archivo de datos complementarios 2). Se detectó la formación de 3 → 3 dímeros reticulados en un mutante ΔdapF (Fig. S4 complementaria), pero el análisis de espectrometría de masas no permitió discriminar entre los dos estereoisómeros DAP. Nuestro análisis de peptidoglicano mostró además que la eliminación de dapF no impidió el anclaje de la lipoproteína de Braun al PG (Fig. S4 complementaria). Por lo tanto, las l,d-transpeptidasas, de forma similar a las PBP, toleraron hasta cierto punto la incorporación de l,l-DAP en los precursores de peptidoglucano después de la eliminación de dapF. La esencialidad de dapF en la condición +CRO podría explicarse por una eficacia reducida de la ruta de ensamblaje de PG, como se observó anteriormente para el mutante nulo de ldcA.

Excepto dapF, todos los genes que codifican enzimas involucradas en los pasos biosintéticos de PG que se sabe que son realizados por una sola enzima se identificaron como esenciales en las condiciones +CRO y −CRO (Fig. 4a). Los datos de los pasos biosintéticos esenciales que involucran funciones enzimáticas redundantes se informan en la Fig. S5 complementaria.

El polímero más externo de la pared celular de la mayoría de las cepas de E. coli es una cápsula hecha de ácido colánico43. WcaJ cataliza el primer paso comprometido en el ensamblaje del precursor del ácido colánico. El gen que codifica WcaJ no era esencial en las condiciones -CRO y +CRO, lo que indica que la ausencia de la cápsula era compatible para el crecimiento tanto en ausencia como en presencia de ceftriaxona (Fig. 4b-d). Inesperadamente, todas las demás enzimas en la vía de síntesis del ácido colánico fueron esenciales en las condiciones +CRO pero no en las −CRO (Archivo de datos complementarios 1b; Archivo de datos complementarios 2). Dado que se espera que la pérdida de todas las demás enzimas de biosíntesis del ácido colánico resulte en la acumulación de precursores unidos a undecaprenilo, llegamos a la conclusión de que estas enzimas son esenciales para prevenir el secuestro del transportador de lípidos. Según este modelo, el secuestro de C55 inhibiría indirectamente el ensamblaje de otros polímeros, como el PG esencial, que depende del mismo transportador lipídico. Como confirmación, mostramos que la eliminación del gen que codifica WcaJ, catalizando el primer paso comprometido de la síntesis del precursor del ácido colánico, restauró el crecimiento de un mutante WcaI en presencia de ceftriaxona (Fig. S6a complementaria). Combinados, estos resultados indican que la cápsula, en sí misma, no es esencial para el crecimiento en presencia de ceftriaxona, aunque las enzimas biosintéticas del ácido colánico son esenciales para evitar la reducción de la síntesis de PG mediante el secuestro del transportador lipídico.

Se ensamblan tres polímeros de ECA a partir del mismo precursor unido a C55 (Fig. 5)44. Los ECA compuestos de 1 a 14 unidades del precursor se unen covalentemente a lipopolisacáridos (ECALPS) oa fosfatidilglicéridos (ECAPGL) en la valva externa de la membrana externa. Las ECA cíclicas libres (ECACYC), compuestas por cuatro unidades, se encuentran en el periplasma.

a Síntesis de precursores de azúcar de nucleótidos de ECA. b Ensamblaje de la subunidad ECA unida al transportador lipídico de undecaprenilo. c Polimerización y transporte de ECA a la superficie celular. d Síntesis de precursores de nucleótidos de azúcar LPS del núcleo. e Montaje del núcleo LPS. f Transporte de LPS a la superficie celular. Abreviaturas: transportador de lípidos de undecaprenilo C55; membrana interna IM; membrana externa de OM; fosfato de P.

Ninguno de los tres polímeros ECA fue esencial en la condición −CRO ya que se detectaron inserciones de transposones en genes que codifican enzimas involucradas en la síntesis de precursores de nucleótidos de azúcar (Fig. 5a) y para el ensamblaje de la subunidad trisacárido ligada a C55 (Fig. 5b). Por el contrario, la mayoría de las enzimas fueron esenciales en la condición +CRO, lo que indica que al menos uno de los tres polímeros ECA era esencial para la resistencia (Archivo de datos complementarios 1b; Archivo de datos complementarios 2). La síntesis de ECALPS y ECACYC fue prescindible para la resistencia ya que la eliminación de los genes que codifican las ligasas WaaL y WzzE, solas o en combinación, fue prescindible para el crecimiento en presencia de ceftriaxona (Fig. 5c; Fig. Suplementaria S6b). El fenotipo del doble mutante indica la ausencia de redundancia entre ECALPS y ECACYC para la resistencia a ceftriaxona. Por eliminación, estos resultados indican que la síntesis de ECAPGL es esencial para la resistencia, aunque esto no se pudo establecer directamente ya que aún no se ha identificado la polimerasa correspondiente.

Se sabe que el lípido A, sustituido por dos residuos de 3-desoxi-d-mano-octulosonato, es el resto mínimo de LPS necesario para el crecimiento de E. coli45. En consecuencia, la mayoría de las enzimas involucradas en su síntesis y transporte a la membrana externa fueron esenciales en las condiciones -CRO y +CRO (Fig. 5d-f). Enzimas aguas abajo, responsables de la síntesis de la subunidad ADP-l-glicero-d-mano-heptosa (RpiA, Rpe, GmhA, HldE, GmhB y HldD), la adición de una d-mano-heptosa a la cadena de sacáridos ( WaaC), y la fosforilación de este residuo (WaaP), fueron esenciales solo en la condición +CRO. Las adiciones de un segundo residuo de d-mano-heptosa (WaaF) y d-glucosa (WaaG) también fueron esenciales para la resistencia (Archivo de datos complementarios 1b; Archivo de datos complementarios 2). Las enzimas que catalizaban los tres pasos subsiguientes en el ensamblaje del núcleo externo (WaaQ, B y R) eran necesarias para un crecimiento óptimo en la condición +CRO. Solo tres enzimas de la vía (WaaY, J y U) eran totalmente prescindibles tanto en las condiciones −CRO como +CRO. Estos resultados indican que el crecimiento en presencia de ceftriaxona no fue compatible con la síntesis incompleta de LPS.

Los ensayos puntuales revelaron que el crecimiento en la condición +CRO estaba asociado con un fenotipo mucoide, un fenotipo que se sabe que resulta de la sobreproducción de ácidos colánicos por parte de las células estresadas. Esta observación plantea la posibilidad formal de que la esencialidad de los azúcares centrales ldcA, dapF, ECAPGL y LPS en la condición +CRO (arriba) podría depender de la sobreproducción de ácidos colánicos por bacterias expuestas a ceftriaxona. Este no fue el caso ya que ldcA, dapF, wecA y waaC siguieron siendo esenciales en las cepas ΔwcaJ deficientes en la síntesis de ácido colánico (Fig. S6c complementaria).

El genoma de E. coli codifica seis miembros de la familia de proteínas LDT (Fig. S1 complementaria). YcbB y YnhG catalizan la formación de enlaces cruzados 3 → 3, mientras que ErfK, YbiS e YcfS son responsables de unir covalentemente la lipoproteína de Braun (Lpp) a PG10,11. La enzima restante, YafK, hidroliza el enlace Lpp-PG formado por ErfK, YbiS e YcfS, liberando así la lipoproteína46,47. El análisis Tn-seq mostró que la lipoproteína de Braun es prescindible para el crecimiento tanto en condiciones de −CRO como de +CRO. Los análisis de la estructura de PG revelaron que el crecimiento en presencia de ceftriaxona redujo drásticamente el anclaje de la lipoproteína de Braun a PG (Figura complementaria S7). Los análisis de transferencia Western mostraron que la síntesis de Lpp no ​​se redujo en la condición + CRO (Fig. S7g complementaria). Por lo tanto, la ceftriaxona puede inhibir la reacción de anclaje catalizada por las LDT (Figura complementaria S1), pero es poco probable que esta inhibición sea directa, ya que los β-lactámicos no inhiben de manera efectiva las LDT, excepto los que pertenecen a la clase carbapenem23,24.

Cualquier hipótesis sobre el modo de inhibición del anclaje de Lpp a PG por parte de los β-lactámicos debe tener en cuenta el hecho de que las LDT para el entrecruzamiento de PG (YcbB y YnhG) y para el anclaje de Lpp (ErfK, YbiS e YcfS) interactúan con el mismo sustrato donante, un tallo donante de tetrapéptido, en el primer paso catalítico común a los dos tipos de reacciones de transpeptidación de l, d (Figura complementaria S1b, S1c) 12. En el segundo paso, las enzimas acilo resultantes reaccionan con un tallo de peptidoglicano para formar enlaces cruzados 3 → 3 o con Lpp para unir covalentemente la lipoproteína a la PG. El sustrato común del primer paso de las reacciones de transpeptidación implica que la competencia de las LDT por el mismo donante de tetrapéptido, como se propuso anteriormente47, puede contribuir a limitar el anclaje de la lipoproteína de Braun a la PG. Sin embargo, esto parece poco probable en el contexto de la resistencia a la ceftriaxona mediada por YcbB, ya que la alta proporción de 3 → 3 enlaces cruzados en la condición +CRO (40 %) no fue perjudicial para el anclaje de Lpp (Figura complementaria S7). Por lo tanto, el deterioro del anclaje de Lpp en presencia de ceftriaxona puede deberse a otro efecto inhibitorio indirecto de la ceftriaxona sobre la actividad de ErfK, YbiS e YcfS, como la formación de su sustrato tetrapeptídico por una enzima asociada, o la estimulación de la liberación de la lipoproteína por YafK.

Habiendo evaluado el papel de los componentes de la membrana externa en la integridad de la membrana externa en presencia de ceftriaxona, nuestro siguiente objetivo fue determinar su funcionalidad como barrera de permeabilidad. En ausencia de inductores de ycbB y relA', se detectó la hidrólisis de rojo de clorofenol-β-d-galactopiranósido (CPRG) por la β-galactosidasa LacZ citoplasmática en un anillo estrecho en el perímetro de la zona de inhibición de ceftriaxona (Fig. 6a) . Por lo tanto, la exposición a concentraciones subinhibitorias cercanas a la concentración inhibitoria mínima (MIC) del fármaco resultó en un aumento de la permeabilidad ya que no existe un transportador específico para CPRG. Tras la inducción de ycbB y relA', se detectó actividad de LacZ en una gran zona que muestra que la ceftriaxona aumentaba la permeabilidad a concentraciones que eran mucho más bajas que la MIC de esa cepa. El crecimiento en presencia de ceftriaxona sensibilizó a las bacterias al dodecilsulfato de sodio (SDS), lo que resultó en una reducción > 40 veces de la CIM del detergente (Fig. 6b). El crecimiento en presencia de ceftriaxona también aumentó la susceptibilidad a la vancomicina, la moenomicina, la bacitracina y la eritromicina, que se sabe que penetran poco en la membrana externa de las bacterias gramnegativas (Fig. 6c). Juntos, estos datos indican que la derivación de PBP por YcbB se asoció con la permeabilización de la membrana externa en presencia de ceftriaxona. Esto implica que el modo de acción de los β-lactámicos puede implicar un bucle positivo en el que la unión de los fármacos a sus dianas promueve el acceso del fármaco al periplasma. El daño a la membrana externa mediado por especies reactivas de oxígeno (ROS) puede estar involucrado en este proceso, ya que se detectó una mayor peroxidación de lípidos mediante un ensayo colorimétrico (Fig. S7h complementaria).

a Hidrólisis de CPRG cromogénico a 20 µg/ml por LacZ63 citoplasmático. Los discos se cargaron con 30 µg de ceftriaxona. b Eficiencia de recubrimiento en presencia de SDS. El crecimiento se probó en presencia de ceftriaxona a 8 µg/ml (+ceftriaxona) o en ausencia del fármaco (−ceftriaxona) en placas de agar BHI suplementadas con IPTG 40 µM y L-arabinosa al 1 % para la inducción de ycbB y relA'. , respectivamente. c Diámetros de inhibición de fármacos que no penetran la membrana externa de E. coli de tipo salvaje. Los valores son la mediana de tres repeticiones biológicas. d Cascada de eventos que conducen a la muerte celular bacteriana debido a la inactivación de las PBP por los betalactámicos. e Rescate de la inactivación de PBP por la YcbB l,d-transpeptidasa. Abreviaturas: membrana interna IM; membrana externa de OM; lipoproteína Lpp Braun; Proteínas de la membrana externa de las OMP. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Los objetivos de los β-lactámicos y el mecanismo de su inactivación se conocen desde hace décadas y, sin embargo, la comprensión de la cascada de eventos posteriores que conduce a la muerte de las células bacterianas sigue siendo poco conocida. El modelo más reciente (Fig. 6d) propone que la inactivación de las PBP da como resultado la producción de cadenas de glucano no reticuladas en el periplasma y su posterior escisión por enzimas líticas19,21. La demanda anabólica generada por este ciclo inútil de síntesis y degradación de PG genera alteraciones en el metabolismo central del carbono, la síntesis de proteínas y la utilización de ATP que conducen a la producción de ROS que dañan las biomoléculas, incluidos el ADN, el ARN, las proteínas y los lípidos. El estrés oxidativo resultante contribuye a la muerte celular18,48.

El rescate de la inactivación de PBP por parte de YcbB implica, en su sentido más simple, una derivación de la actividad de entrecruzamiento de las PBP mediante el reemplazo de 4 → 3 por 3 → 3 entrecruzamientos (Fig. 1). Sin embargo, nuestro análisis muestra que la resistencia a los β-lactámicos es significativamente más compleja, ya que los efectos tóxicos de la inactivación de las PBP persistieron a pesar de la derivación de su actividad d,d-transpeptidasa por parte de YcbB. De acuerdo, se detectó una mayor peroxidación de lípidos en la condición + CRO (Fig. S7h complementaria). Los genes identificados como selectivamente esenciales en la condición +CRO (Fig. 2; Archivo de datos complementarios 1b) revelaron la complejidad de las funciones que se movilizan para mitigar estos efectos tóxicos (Fig. 6e).

Se demostró previamente que el desacoplamiento de la transglicosilación mediada por RodA de la transpeptidación mediada por PBP2 tras la inactivación de esta PBP por β-lactámicos tiene efectos opuestos sobre la viabilidad de las bacterias susceptibles y resistentes. En bacterias susceptibles, la acumulación de hebras de glucano no reticuladas después de la inactivación de PBP2 por β-lactámicos es perjudicial y su degradación por la transglucosilasa lítica SltY contribuye a la supervivencia celular21. Por el contrario, la inactivación de SltY favorece la resistencia mediada por YcbB a los β-lactámicos, con cadenas de glicano no reticuladas formadas por el complejo de elongasoma que sirven como sustratos adecuados para el ensamblaje de un polímero de PG funcional7. Los experimentos de marcado de pulsos indicaron que YcbB admitía la polimerización de PG a través de un mecanismo de dos pasos que implicaba (i) ensamblaje de 3 → 3 hebras de glucano reticuladas seguido de (ii) inserción del polímero neosintetizado resultante en el PG49 existente. En el presente trabajo, proporcionamos evidencia directa de que este modo de polimerización de peptidoglicano requiere un elongosoma funcional, que apoya la polimerización de la cadena de glicano mediante RodA catalíticamente activo (Fig. 3).

El reciclaje de PG se estimula en la condición +CRO49. Esto implica que el rescate de PBP por YcbB reduce pero no elimina la alta demanda anabólica necesaria para alimentar la ruta de ensamblaje de PG en presencia de la droga. Aquí mostramos que la reducción del flujo metabólico de los precursores en la ruta de ensamblaje de PG no es compatible con la resistencia a los β-lactámicos mediada por YcbB. Se observó que este era el caso de las deleciones de dapF o ldcA, que conducían a la síntesis de precursores aberrantes que contenían l, l-DAP o un tallo de tetrapéptido, respectivamente (Fig. 4a). Este también fue el caso de la inactivación de genes que codifican enzimas de síntesis de ácido colánico que condujeron al secuestro del transportador de lípidos undecaprenilo utilizado competitivamente para la síntesis de PG (Fig. 4b-d). El exceso residual en la demanda anabólica también puede tener consecuencias no directamente relacionadas con la eficacia de la síntesis de PG. De hecho, una demanda anabólica elevada implica que la producción de ROS permanece elevada. La defensa exitosa contra el estrés oxidativo resultante puede explicar las funciones selectivamente esenciales de los reguladores, chaperonas y enzimas involucradas en la reparación de macromoléculas (Fig. 2e; Archivo de datos complementarios 1b).

Sorprendentemente, descubrimos que la resistencia también dependía de ECAPGL (Fig. 5a), LPS con un azúcar central completo (Fig. 5b-d), de componentes del sistema Tol-Pal (Fig. 3a) y de proteínas de la membrana externa que incluyen OmpA y OmpC (Archivo de datos complementarios 1b; Archivo de datos complementarios 2). Los análisis de morfología bacteriana mostraron recientemente que la membrana externa contribuye directamente a las propiedades mecánicas de la envoltura celular, un papel históricamente atribuido únicamente a la capa de PG50,51. Sorprendentemente, los componentes estabilizadores esenciales para la rigidez de la membrana externa identificados en uno de estos informes anteriores50 incluyeron LPS con un núcleo de azúcar completo, el sistema Tol-Pal y OmpA, también identificado aquí como esencial para la resistencia a la ceftriaxona mediada por YcbB. Por lo tanto, el ensamblaje de una envoltura funcional en presencia de ceftriaxona requería tanto la derivación de la actividad d,d-transpeptidasa de las PBP por la actividad l,d-transpeptidasa de YcbB como la inserción de polímeros críticos en la membrana externa.

En conclusión, el rescate de las PBP por parte de YcbB, junto con una pantalla Tn-seq de todo el genoma, reveló dos impactos inesperados de los β-lactámicos. En primer lugar, la exposición a la ceftriaxona impidió el anclaje de la lipoproteína de Braun a la PG mediada por la l,d-transpeptidasa (Figura complementaria S7). En segundo lugar, la exposición a la ceftriaxona aumentó la permeabilidad de la membrana externa (Fig. 6). El último efecto implica que la penetración autopromovida a través de la membrana externa es una faceta previamente no reconocida del modo de acción de los β-lactámicos. Además, nuestros datos muestran que el ciclo fútil inducido por β-lactámicos solo era sostenible si la eficacia de la ruta de ensamblaje de peptidoglicano no se veía comprometida por pasos biosintéticos ineficaces o por la competencia con el ensamblaje de otros polímeros que dependen del portador de lípidos undecaprenilo común. El PG reticulado por YcbB era funcional, aunque la integridad de la envoltura celular dependía en gran medida de los polímeros de la membrana externa que, de otro modo, serían prescindibles para el crecimiento. Por lo tanto, la identificación de los genes involucrados en el rescate de PBP por YcbB proporcionó una pantalla positiva para identificar las respuestas bacterianas que evitan la muerte bacteriana por β-lactámicos. Por el contrario, los análisis metabólicos restringidos a bacterias susceptibles son insensibles a las diferencias entre las perturbaciones específicas de los antibacterianos y la multitud de efectos secundarios relacionados con la muerte celular19. En consecuencia, nuestro análisis proporciona evidencia convincente de que la membrana externa, más allá de su conocido papel como barrera de permeabilidad52, es un actor clave en el modo de acción de los β-lactámicos y en la resistencia a los β-lactámicos mediada por la l,d-transpeptidasa. como se encontró previamente para la tolerancia a estos fármacos en varias especies bacterianas53,54,55,56. A su vez, nuestro análisis identifica posibles objetivos procesables para aumentar la eficacia de los β-lactámicos contra las bacterias resistentes.

Las características y el origen de los plásmidos y las cepas utilizadas en el estudio se enumeran en la Tabla complementaria S1. Las bacterias se cultivaron a 37 °C en agar o caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI; Difco) con aireación (agitación a 180 rpm). Se usó kanamicina a 50 µg/ml para la selección de transductores que portaban el casete KmR obtenido de la colección Keio. Los medios de crecimiento se complementaron sistémicamente con fármacos para contrarrestar la pérdida de plásmido: 10 µg/ml de tetraciclina para el plásmido pKT2, 20 µg/ml de cloranfenicol para pKT8, 25 µg/ml de zeocina para pHV30 y derivados. La inducción de los promotores Ptrc, ParaBAD y PrhaBAD se realizó con isopropil β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG, 40 µM), l-arabinosa (1%) y l-ramnosa (0,2%), respectivamente. Los plásmidos construidos en este estudio se obtuvieron mediante el método de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi (New England Biolabs), a menos que se especifique lo contrario. Se obtuvieron deleciones de genes específicos por transducción P1 del casete KmR de mutantes seleccionados de la colección Keio57,58. Para deleciones de múltiples genes, el casete KmR fue eliminado por la recombinasa FLT codificada por el plásmido pCP20.

Se cultivó una colonia reciente de Escherichia coli BW25113 ΔrelA pKT2(ycbB) pKT8(relA') en 10 ml de caldo BHI suplementado con 10 µg/ml de tetraciclina y 20 µg/ml de cloranfenicol. A una densidad óptica a 600 nm (OD600nm) de ca. 0,8, las células se recogieron por centrifugación y se lavaron cuatro veces con 10 ml de H2O a 4 °C. Se realizaron electroporaciones múltiples (ver a continuación) usando 100 µl de células electrocompetentes y 1 µl de EZ-Tn5 < KAN-2> transposome® (Lucigen). Para cada electroporación, las células transformadas se incubaron a 37 °C durante 1 h en 2 ml de caldo BHI suplementado con 10 µg/ml de tetraciclina y 20 µg/ml de cloranfenicol. Las células se sembraron en 20 placas de agar BHI (100 µl por placa) complementadas con kanamicina 50 µg/ml, IPTG 40 µM y L-arabinosa al 1 % en ausencia (condición −CRO) o presencia (condición +CRO) de 8 µg /ml ceftriaxona. Las placas se incubaron a 37 °C durante 16 h (condición −CRO) o 24 h (condición +CRO). Las células se recuperaron de juegos de 20 placas (correspondientes a la misma electroporación) en dos pasos raspando con 4 ml de caldo BHI que contenía 20 % de glicerol seguido de un lavado adicional de las placas con 4 ml del mismo medio. Las suspensiones bacterianas obtenidas para cada electroporación se mantuvieron a -80 °C. Para la condición −CRO se obtuvo un total de 810.000 UFC en 7 electroporaciones. Para la condición +CRO se obtuvo un total de 260.000 UFC en 10 electroporaciones.

Para la extracción de ADN, se agruparon 10 µl de las suspensiones bacterianas obtenidas en las 7 (condición −CRO) o 10 (+condición CRO) electroporaciones. La extracción de ADN se realizó con el kit de purificación de ADN Wizard Genomic (Promega) por duplicado para obtener repeticiones técnicas.

La preparación de las bibliotecas de ADN y la secuenciación de Illumina fueron realizadas por la empresa Viroscan3D y la plataforma ProfileXpert de la Université de Lyon 1. Brevemente, el ADN se fragmentó (aprox. 300 pb) y los adaptadores P5 Illumina se vincularon al ADN fragmentado. Los fragmentos de unión en ambos lados de EZ-Tn5 se amplificaron utilizando el cebador Illumina P5 estándar en asociación con el cebador HV1 o HV2 que hibridiza con Tn5 que lleva el adaptador Illumina P7 en el extremo 5 '(Tabla complementaria S1). Los índices fueron llevados por los cebadores Tn izquierdo o Tn derecho. La secuenciación de Illumina se realizó en un NextSeq Mid Output de 150 pb (extremo emparejado: 40–110). La demultiplexación y el recorte de las lecturas se realizaron antes de la alineación con el genoma de referencia de E. coli BW25113 (número de acceso de NCBI: CP009273).

El análisis se realizó con el paquete TRANSIT (v.3.0+) de Python (v.3.7)59. El componente TPP se utilizó para procesar lecturas experimentales sin procesar y generar archivos WIG para el análisis posterior. Las lecturas de extremos emparejados de Illumina con sitios de inserción EZ-Tn5 se identificaron seleccionando primero aquellos con la secuencia final de transposón "TAAGAGACAG" esperada entre los nucleótidos 25 y 50 de cada lectura. La secuencia inversa de 110 pb (cebador de secuenciación del adaptador P7) se usó en todos los casos, ya que contenía tanto secuencias EZ-Tn5 como genómicas. Luego, las lecturas de EZ-Tn5 se asignaron a la secuencia de referencia de E. coli BW25113 utilizando BWA (v.0.7.17)60. Se generaron archivos WIG combinados correspondientes a las uniones izquierda y derecha para cada experimento. Los eventos de inserción de transposones se asignaron a marcos de lectura/genes abiertos específicos utilizando el archivo GFF3 GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/) correspondiente a la secuencia genómica FASTA. La normalización del número de inserciones por ORF/gen se realizó mediante lecturas totales recortadas (TTR): recuentos de lectura totales normalizados después de recortar el 5 % superior e inferior de los recuentos de lectura. Se calcularon los recuentos medios de inserción para cada condición experimental: la media de las uniones izquierda y derecha de cada uno de los dos experimentos.

Los fragmentos de unión se alinearon con el genoma de referencia de E. coli BW25113 y los genes esenciales se llamaron utilizando el algoritmo Tn5Gaps de la canalización TRANSIT (archivo de datos complementarios 1a)59. El conjunto de genes selectivamente esenciales en la condición +CRO se construyó mediante: (1) Identificación de genes esenciales en las dos réplicas de +CRO y no esenciales en las dos réplicas de −CRO (subconjunto 1). (2) Agregar genes con una discrepancia entre los duplicados técnicos, por ejemplo, marcados como no esenciales en un conjunto de datos +CRO o esenciales en un conjunto de datos −CRO (subconjunto 2). (3) Se calcularon las lecturas promedio por gen para identificar las inserciones de transposones que están significativamente subrepresentadas (valor p <0.05) en la condición +CRO (Archivo de datos complementarios 1a). Se eliminaron los genes de los subconjuntos 1 y 2 que arrojaron un valor de p > 0,05 o un cambio de veces < 4. El conjunto resultante de 179 genes se enumera en el archivo de datos complementarios 1b. Para vías o grupos de genes que contienen selectivamente genes esenciales en la condición +CRO, también consideramos genes no esenciales que muestran un número significativamente reducido de inserciones en la condición +CRO (p < 0,05). Se consideró que estos genes incurrían en un costo de aptitud.

Las secuencias guía de 20 nucleótidos dirigidas a mrdA (GTCTACAGTTAAACCCTATG) y rodA (GGTGGCTGCACAGCCTGACC) se introdujeron de forma independiente en el plásmido pTargetF61 mediante amplificación por PCR invertida utilizando los cebadores HV3 y HV4 o HV5 y HV6 (Tabla complementaria S1) para generar pTargetF-mrdA y pTargetF-rodA , respectivamente. Brevemente, pTargetF fue amplificado por PCR con Phusion DNA polimerasa (Thermo Scientific), los productos de PCR fueron digeridos por la enzima de restricción DpnI (Thermo Scientific) y purificados por electroforesis en gel de agarosa. Los productos de PCR purificados se fosforilaron y ligaron con la polinucleótido quinasa T4 y la ADN ligasa T4 (Thermo Scientific) en una reacción de un solo recipiente, y los plásmidos pTargetF-mrdA y pTargetF-rodA resultantes se introdujeron en E. coli TOP10 mediante electroporación.

GeneCust sintetizó los ADN donantes mrdA S330A, mrdA S330C, rodA D159A, rodA D159N, ΔmrdA y ΔrodA y los clonó en pUC57. Los ADN de donante utilizados para introducir mutaciones puntuales corresponden a la secuencia del mrdA o rodA con mutación missense en el codón de interés y mutaciones silenciosas en la secuencia correspondiente a los 20 nucleótidos utilizados para guiar a Cas9 en la copia cromosómica del gen (para evitar posteriores escisión por Cas9 después del intercambio alélico). Los ADN del donante utilizados para introducir deleciones corresponden a las secuencias de 100 pb cadena arriba, los primeros seis codones, los últimos ocho codones y las secuencias de 100 pb cadena abajo de mrdA o rodA. Los ADN del donante se amplificaron de forma independiente mediante PCR con la ADN polimerasa Phusion (Thermo Scientific) y los cebadores HV7 a HV14 que se muestran en la Tabla complementaria S1. Los productos de PCR se digirieron con la enzima de restricción DpnI (Thermo Scientific) y se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa.

Método adaptado de Jiang Y. et al.61. Se cultivó una colonia fresca de E. coli BW25113 ΔrelA pKT8(relA') pCas a 30 °C con agitación en 10 ml de caldo BHI suplementado con 1 % de l-arabinosa para inducir la expresión tanto de relA' como del sistema λ Red, y con 20 µg/ml de cloranfenicol y 50 µg/ml de kanamicina para contrarrestar la pérdida de plásmidos. A una OD600nm de ca. 0,8, las células se recogieron por centrifugación y se lavaron cuatro veces con 10 ml de H2O a 4 °C. Las bacterias se sometieron a electroporación con el plásmido pTargetF-mrdA y el ADN donante mrdA S330A, mrdA S330C o ∆mrdA, o con el plásmido pTargetF-rodA y el ADN donante rodA D159A, rodA D159N o ∆rodA con una relación molecular de 1 plásmido por 5000 ADN donante moléculas. Las células transformadas se incubaron a 30 °C durante 2 h en 1 ml de caldo BHI complementado con 1 % de l-arabinosa, 20 µg/ml de cloranfenicol y 50 µg/ml de kanamicina. Las bacterias se sembraron en agar BHI suplementado con 1% de l-arabinosa, 50 µg/ml de kanamicina y 120 µg/ml de espectinomicina y se incubaron a 30 °C durante 24 h. Para deshacerse de pTargetF-mrdA o pTargetF-rodA, los transformantes se aislaron en el mismo medio suplementado adicionalmente con IPTG 500 µM para la inducción del sgRNA codificado por pCas dirigido al plásmido pTargetF y se incubaron a 30 °C durante 24 h. Las deleciones cromosómicas o mutaciones puntuales se verificaron mediante PCR y secuenciación de Sanger. Para deshacerse del plásmido pCas termosensible, los clones que albergaban las mutaciones esperadas se cultivaron en caldo BHI suplementado con L-arabinosa al 1 % e IPTG 500 µM a 37 °C durante 6 h y se aislaron en agar BHI suplementado con L-arabinosa al 1 % a 37 °C durante 16 h. Los clones aislados se subcultivaron en caldo BHI suplementado con L-arabinosa al 1 % a 37 °C durante 6 h y se aislaron en agar BHI suplementado con L-arabinosa al 1 % a 37 °C durante 16 h. Se probó la susceptibilidad de los clones aislados a la espectinomicina (pérdida de derivados de pTargetF) y la kanamicina (pérdida de pCas) para confirmar la pérdida de estos plásmidos.

Las bacterias se cultivaron hasta la última fase exponencial, es decir, hasta una DO600nm de 1,0 a 4,0 (aprox. 6 ha 37 °C con agitación vigorosa). La OD600nm se ajustó a 1,0 y se prepararon diluciones de 10 veces (10-1 a 10-5) en caldo BHI. Se colocaron cinco µl de las suspensiones bacterianas resultantes en placas de agar BHI suplementadas con inductores y fármacos como se indica en la leyenda de las figuras. Para el ensayo de difusión en disco, se inocularon 5 µl de la suspensión bacteriana a una DO600nm de 1,0 en 5 ml de agua. Las placas de agar BHI se inundaron con la última suspensión, se eliminó el exceso de líquido y las placas se mantuvieron a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de agregar los discos de papel que contenían antibióticos. Para el ensayo de clorofenol rojo-β-d-galactopiranósido (CPRG), se utilizó la cepa BW25113(ycbB, relA') que alberga pHV30bis(lacZ) ya que la cepa parental BW25113 no expresa la copia cromosómica de lacZ. Se tomaron imágenes de las placas o se midieron los diámetros de inhibición después de 16 h (o 24 h para las placas que contenían ceftriaxona) de incubación a 37 °C. Los datos que se muestran en las figuras son representativos de al menos dos repeticiones biológicas y los diámetros de inhibición medidos son la mediana de tres repeticiones biológicas.

Las bacterias se cultivaron en caldo BHI hasta la última fase exponencial, es decir, hasta una DO600nm superior a 1,0 (aprox. 6 ha 37 °C con agitación). Diez µl de las suspensiones bacterianas resultantes se sembraron en agar BHI suplementado con inductores (IPTG 40 µM y L-arabinosa al 1 %) y fármacos (10 µg/ml de tetraciclina y 20 µg/ml de cloranfenicol, o 8 µg/ml de ceftriaxona). Para cada réplica se utilizaron 5 placas de agar BHI con el fin de obtener una cantidad suficiente de bacterias. Las placas se incubaron durante 16 h (o 24 h para las placas que contenían ceftriaxona) a 37 °C. Las bacterias se recogieron en dos pasos desechando cada placa con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,2 seguido de un lavado adicional de la placa con 1 ml de PBS. Las bacterias se hirvieron en 0,5 × PBS suplementado con dodecilsulfato de sodio (SDS) al 4 % en un volumen final de 20 ml durante 1 hora. Los sacculi se recogieron por centrifugación (20.000 × g durante 20 min a 20 °C), se lavaron cinco veces con 20 ml de agua, se resuspendieron en 1 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, y se incubaron con 100 µg/ml de pronasa a 37ºC. ºC durante 16 h. Los sacos se lavaron cinco veces con 1 ml de agua, se resuspendieron en 1 ml de fosfato de sodio 20 mM pH 8,0 y se incubaron con 100 µg/ml de tripsina a 37 °C durante 16 h. Los sacculi se lavaron cinco veces con 1 ml de agua, se hirvieron durante 5 min, se recolectaron por centrifugación, se resuspendieron en 300 µl de agua y se almacenaron a -20 °C.

Se digirieron diez µl de sacculi purificados con lisozima 120 µM en Tris-HCl 40 mM pH 8,0 a 37 °C durante 16 h. El material insoluble se eliminó por centrifugación a 20.000 × g en una microcentrífuga durante 10 min, y la fracción soluble que contenía muropéptidos se redujo con borohidruro de sodio en tampón de borato 125 mM pH 9,0 durante 1 h a temperatura ambiente. Se utilizó ácido fosfórico para ajustar el pH a 4,0. Los muropéptidos se separaron por rpHPLC en una columna C18 (Hypersil GOLD aQ; 250 × 4,6 mm; 3 µm, Thermo Scientific) a un caudal de 1 ml/min con un gradiente lineal (0-20 %) aplicado entre 10 y 60 min (tampón A, TFA al 0,1 %; tampón B, acetonitrilo al 99,9 %, TFA al 0,1 %, v/v). Se controló la absorbancia a 205 nm y se recogieron las fracciones, se liofilizaron, se resuspendieron en agua y se analizaron mediante espectrometría de masas. Los espectros de masas se obtuvieron en un espectrómetro de masas de alta resolución Bruker Daltonics maXis (Bremen, Alemania) que funciona en modo positivo (Plataforma analítica del Muséum National d'Histoire Naturelle, París, Francia). Los datos de espectro de masas se exploraron utilizando mineXpert262.

BW25113(ycbB, relA') se cultivó en las condiciones -CRO y +CRO en placas de agar BHI como se realizó para la preparación de sacculi. Las bacterias se lisaron con SDS al 4 % a 96 °C durante 45 min. Los extractos bacterianos crudos se separaron por SDS-PAGE. Lpp y RpoA (utilizados como control de carga) se detectaron con anticuerpos policlonales de conejo y ratón proporcionados por JF Collet y C. Beloin, respectivamente. Los anticuerpos primarios se diluyeron a 1/10.000 (v/v). La detección se realizó con anticuerpos anti-conejo acoplados a peroxidasa (Sigma) y anti-ratón (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante del sustrato de transferencia Western PierceTM ECL (Thermo Scientific). Los anticuerpos secundarios se diluyeron a 1/2000 (v/v).

BW25113(ycbB, relA') se cultivó a 37 °C en caldo BHI suplementado con IPTG 40 µM y 1% de l-arabinosa para inducir la expresión de ycbB y relA', respectivamente. A una OD600nm de ca. Se añadieron 0,25 \mu l de ceftriaxona y se continuó la incubación durante 2 h. Se recogieron bacterias (1 ml), se lisaron y se determinó la concentración de malondialdehído (MDA) según las instrucciones del fabricante del kit de ensayo MDA de peroxidación de lípidos (Sigma).

Para el análisis Tn-seq, la reproducibilidad se aborda mediante la correlación de números de lectura promedio normalizados por CDS para dos réplicas técnicas secuenciadas obtenidas para las condiciones -CRO y +CRO (Fig. 2a, b). El tratamiento estadístico de los datos de Tn-seq se describe bajo el encabezado "Determinación de la esencialidad del gen y el costo de aptitud" en la sección "Métodos". Los valores de p se obtuvieron a partir de pruebas t de dos colas no apareadas. Para los ensayos de eficiencia de placas, se realizaron al menos dos repeticiones biológicas (los datos en cifras provienen de un experimento representativo). Para el análisis de peptidoglicanos por rpHPLC y espectrometría de masas, se realizaron tres repeticiones biológicas independientes (los datos en cifras proceden de un experimento representativo). Los datos de las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos son medianas de tres repeticiones biológicas independientes. Para el análisis de transferencia Western, las imágenes son un representante de tres repeticiones biológicas. Las concentraciones de malondialdehído (MDA) son la media y la desviación estándar de tres repeticiones biológicas. Los valores de p se obtuvieron a partir de pruebas t de dos colas no apareadas.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de Tn-seq generados en este estudio se han depositado en la base de datos Sequence Read Archive (SRA) con el código de acceso PRJNA907050. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Este trabajo fue apoyado por la Agencia Nacional de Investigación de Francia ANR 'RegOPeps' (subvención ANR-19-CE44-0007 a JEH). HV recibió una beca de doctorado de la Sorbonne-Université (ED 515, Complexité du Vivant). Agradecemos a J. Lachuer y J. Bertrand de la plataforma genómica ProfileXpert/Viroscan3D por la secuenciación de inserción de transposones. Damos las gracias a A. Marie para la asistencia técnica en la colección de espectros de masas en la Plateau Technique de Spectrométrie de Masse Bio-Organique del Muséum national d'Histoire Naturelle. Agradecemos a JF Collet y C. Beloin por la generosa donación de anticuerpos anti-Lpp y anti-RpoA, respectivamente. Damos las gracias a Z. Edoo y F. Rusconi para la lectura crítica del manuscrito.

Estos autores contribuyeron igualmente: Michel Arthur, Jean-Emmanuel Hugonnet.

Centro de Investigación Cordeliers, Universidad de la Sorbona, Inserm, Universidad de la Cité de París, F-75006, París, Francia

Henri Voedts, Guennadi Sezonov, Michel Arthur y Jean-Emmanuel Hugonnet

Institut Pasteur, Universidad Paris Cité, Departamento de Biología Computacional, F-75015, París, Francia

sean p kennedy

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HV: concepción y diseño, adquisición, análisis e interpretación de datos, redacción y revisión del artículo. SK: análisis de datos, redacción y revisión del artículo. GS: redacción y revisión del artículo. MA y JEH: concepción y diseño, análisis e interpretación de datos, redacción y revisión del artículo.

Correspondencia a Michel Arthur o Jean-Emmanuel Hugonnet.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de revisión por pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Voedts, H., Kennedy, SP, Sezonov, G. et al. La identificación en todo el genoma de los genes necesarios para el entrecruzamiento alternativo de peptidoglicanos en Escherichia coli reveló impactos inesperados de los betalactámicos. Nat Comun 13, 7962 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-35528-3

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Recibido: 11 agosto 2022

Aceptado: 06 diciembre 2022

Publicado: 27 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-35528-3

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