La estimulación mecánica controla la función de los osteoclastos a través de la regulación de Ca2+

Oct 27, 2023

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 407 (2023) Citar este artículo

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La carga de fuerza mecánica es esencial para mantener la homeostasis ósea, y la exposición a la descarga puede conducir a la pérdida ósea. Los osteoclastos son las únicas células de reabsorción ósea y juegan un papel crucial en la remodelación ósea. Los mecanismos moleculares que subyacen a los cambios inducidos por la estimulación mecánica en la función de los osteoclastos aún no se han dilucidado por completo. Nuestra investigación anterior encontró que el canal de Cl− activado por Ca2+ Anoctamin 1 (Ano1) era un regulador esencial para la función de los osteoclastos. Aquí, informamos que Ano1 media las respuestas de los osteoclastos a la estimulación mecánica. In vitro, las actividades de los osteoclastos obviamente se ven afectadas por el estrés mecánico, que se acompaña de cambios en los niveles de Ano1, la concentración de Cl- intracelular y la señalización de Ca2+ corriente abajo. Ano1 knockout o mutantes de unión a calcio embota la respuesta de los osteoclastos a la estimulación mecánica. In vivo, la eliminación de Ano1 en osteoclastos embota la inhibición de osteoclastos inducida por la carga y la pérdida ósea inducida por la descarga. Estos resultados demuestran que Ano1 juega un papel importante en los cambios de actividad de los osteoclastos inducidos por estimulación mecánica.

La remodelación ósea depende en gran medida de la estimulación mecánica, como lo demuestra el aumento de la masa ósea en los atletas y la pérdida dramática de masa ósea en condiciones de reposo prolongado en cama1 o microgravedad durante los vuelos espaciales2. El estrés mecánico mejora la masa ósea principalmente a través del aumento del número de osteoblastos, promoviendo su actividad y regulando al alza su reclutamiento, estimulando así la formación ósea3,4. Por el contrario, la ausencia de estimulación mecánica reduce la masa ósea al inhibir la formación de hueso5 y promover la osteoclastogénesis y la consiguiente reabsorción ósea6. Tradicionalmente, se ha pensado que los osteoblastos y los osteocitos son las células responsables de detectar los estímulos mecánicos, y su papel en el metabolismo óseo ha sido ampliamente documentado7,8. Sin embargo, los efectos de los estímulos mecánicos sobre los osteoclastos apenas se informaron y el mecanismo de respuesta de los osteoclastos al estrés mecánico aún no se comprende por completo. Para utilizar eficazmente las señales mecánicas en la clínica como una intervención no farmacológica para la osteoporosis, es esencial identificar los componentes del desafío mecánico que son críticos para la remodelación ósea.

Los estímulos mecánicos representan señales ambientales importantes que los organismos vivos tienen que sentir y afrontar5,9. La detección de fuerza mecánica se conserva en todos los dominios de la vida, con una variedad de proteínas involucradas en la detección y respuesta a las fuerzas mecánicas10,11,12. Entre ellos, los canales iónicos mecanosensibles son activados directamente por fuerzas mecánicas aplicadas a las células13,14. Las células convierten los estímulos mecánicos en señales eléctricas o químicas a través de estos canales iónicos mecanosensibles, que se abren y cierran en respuesta a los estímulos mecánicos15,16. Nuestro hallazgo anterior reveló que el canal Piezo1 mecanosensible en los osteoblastos es necesario para la formación de hueso, ya que funciona como un transductor clave de mecanosensibilidad en los osteoblastos8. Sin embargo, los canales iónicos mecanosensibles en los osteoclastos siguen estando menos estudiados.

Anoctamin-1 (ANO1), también conocido como TMEM16A, se identificó como un canal de cloruro activado por calcio. ANO1 juega un papel importante en una variedad de células, incluido el control de la excitabilidad de las células del músculo liso17,18 y las neuronas19, la secreción de fluidos por las células epiteliales20, la sensación de dolor agudo21, la transducción olfativa22, la proliferación, supervivencia y migración de células cancerosas23,24. Nuestro estudio anterior mostró que ANO1 es un regulador esencial de la función de los osteoclastos, y su actividad de canal contribuye a su interacción con RANK, que promueve las vías de señalización aguas abajo inducidas por RANKL25.

La estructura de cryo-EM de Ano1 revela que cada subunidad incluye diez segmentos transmembrana (TM), con TM3-8 que recubren un camino conductor de iones. Los análisis bioinformáticos basados ​​en estrategias para identificar relaciones filogenéticas distantes sugieren que Ano1 está evolutivamente relacionado con los canales mecanosensibles OSCA (canal permeable al calcio activado por hiperosmolalidad)26. Además, dadas las características del mapa crio-EM y las similitudes estructurales entre los canales OSCA mecanosensibles y el canal ANO1, proponemos que las proteínas de la familia ANO poseen las mismas características mecanosensibles que los canales iónicos OSCA mecanosensibles.

En este estudio, encontramos que la estimulación mecánica conduce a cambios en la función de los osteoclastos y Ano1 juega un papel esencial en este proceso. La estimulación mecánica inducida por la tensión de cizallamiento de fluidos (FSS) o la hipergravedad (HG) inhibió la actividad de los osteoclastos, lo que se acompañó de una disminución en los niveles de Ano1. Por el contrario, la descarga mecánica en condiciones de microgravedad simulada (MG) da como resultado un aumento en los niveles de Ano1 y, posteriormente, promueve la actividad de los osteoclastos. La deficiencia de ANO1 en el osteoclasto reduce su sensibilidad a la estimulación mecánica. Mecánicamente, la actividad del canal ANO1 se modificó mediante señalización mecánica, lo que provocó cambios en la concentración de Cl- intracelular y las vías mediadas por calcio. La eliminación de Ano1 en el osteoclasto inhibe significativamente la activación de los osteoclastos inducida por la descarga y alivia la pérdida ósea inducida por la descarga. Estos resultados demuestran que Ano1 es un factor intrínseco que permite que los osteoclastos respondan a la estimulación mecánica.

Para examinar el efecto de la estimulación mecánica en la actividad de los osteoclastos, utilizamos las siguientes tres fuerzas mecánicas, tensión de cizallamiento de fluidos (FSS), hipergravedad (HG) y microgravedad simulada (MG), para estimular los osteoclastos. Se usaron doce dyn/cm2 FSS y 4 g de tratamiento con HG para investigar el efecto de la carga mecánica y el sistema de microgravedad simulado se usó para investigar el efecto de la descarga mecánica en la diferenciación y las actividades de los osteoclastos (Fig. 1a-c complementaria). Se cultivaron macrófagos derivados de médula ósea (BMM) de ratón con M-CSF (10 ng/ml) solo durante 1 día, seguidos de M-CSF (30 ng/ml) y RANKL (50 ng/ml) durante 1 día. 3 días y 5 días. Las células se trataron con FSS, HG y MG en todo el proceso. Examinamos la expresión de los genes marcadores de cada etapa durante la diferenciación de los osteoclastos27,28,29. Cuando las células se trataron con FSS el día 1, no hubo cambios en la expresión de la subunidad alfa X de la integrina (Itgax) y Cd74, genes marcadores de la etapa temprana de diferenciación de osteoclastos (Fig. 2a complementaria). En el día 3, se suprimió la expresión de dendrocitos expresada siete proteínas transmembrana (Dcstamp) y la subunidad d2 de V0 transportadora de ATPasa H + (Atp6v0d2), genes marcadores de preosteoclastos (Fig. 2b complementaria). En el día 5, la expresión del factor nuclear de la célula T activada 1 (NFATc1), la fosfatasa ácida 5 (Acp5), la catepsina K (Ctsk) y la metaloproteína de matriz 9 (Mmp9), genes marcadores de la actividad de los osteoclastos, se redujo significativamente (Fig. 2c). El nivel de proteína de NFATc1 aumentó durante la diferenciación de osteoclastos, y FSS inhibió el nivel de proteína NFATc1 (Fig. 1a). El número de células TRAP+ disminuyó en los osteoclastos tratados con FSS que en los osteoclastos de control (Fig. 1b). Se observaron resultados similares en los osteoclastos después del tratamiento con HG, que no afectó la expresión de Itgax y Cd74, disminuyó la expresión de Dcstamp, Atp6v0d2, NFATc1, Acp5, Ctsk y Mmp9, inhibió el nivel de proteína NFATc1 y disminuyó el número de Células TRAP+ (Fig. 2d-f complementaria, Fig. 1c, d). La microgravedad obviamente mejoró la diferenciación y las actividades de los osteoclastos, la expresión de los genes en la etapa temprana de la diferenciación de los osteoclastos permaneció sin cambios (Fig. 2g complementaria), mientras que la de los genes de preosteoclastos y osteoclastos fue significativamente mayor bajo el tratamiento con MG que en las células de control ( Figura complementaria 2h, i). El nivel de proteína de NFATc1 y el número de células TRAP+ aumentaron significativamente en los osteoclastos tratados con MG que en los osteoclastos de control (Fig. 1e, f).

un análisis de transferencia Western del nivel de proteína NFATc1 durante la diferenciación de osteoclastos bajo tratamiento de estrés de cizallamiento fluido (FSS) durante 1 día, 3 días o 5 días. b Imágenes representativas de la tinción TRAP durante la diferenciación de osteoclastos bajo tratamiento con FSS durante 1 día, 3 días o 5 días (izquierda). Barra de escala, 200 μm. Cuantificación del número de células multinucleadas por cm2 (derecha). (n = 0–231, de tres experimentos independientes). c Análisis de transferencia Western del nivel de proteína NFATc1 durante la diferenciación de osteoclastos bajo tratamiento de hipergravedad (HG) durante 1 día, 3 días o 5 días. d Imágenes representativas de la tinción TRAP durante la diferenciación de osteoclastos bajo tratamiento con HG durante 1 día, 3 días o 5 días (izquierda). Barra de escala, 200 μm. Cuantificación del número de células multinucleadas por cm2 (derecha). (n = 0-291, de tres experimentos independientes). e Análisis de transferencia Western del nivel de proteína NFATc1 durante la diferenciación de osteoclastos bajo tratamiento de microgravedad (MG) durante 1 día, 3 días o 5 días. f Imágenes representativas de la tinción TRAP durante la diferenciación de osteoclastos bajo tratamiento con MG durante 1 día, 3 días o 5 días (izquierda). Barra de escala, 200 μm. Cuantificación del número de células multinucleadas por cm2 (derecha). (n = 0–377, de tres experimentos independientes). g Análisis QRT-PCR del nivel de ARNm de Ano1 durante la diferenciación de osteoclastos bajo tratamiento con FSS durante 1 día, 3 días o 5 días. (n = 3 experimentos independientes). h Análisis de transferencia Western del nivel de proteína Ano1 durante la diferenciación de osteoclastos bajo tratamiento con FSS durante 1 día, 3 días o 5 días. i Análisis QRT-PCR del nivel de ARNm de Ano1 durante la diferenciación de osteoclastos bajo tratamiento con HG durante 1 día, 3 días o 5 días. (n = 3 experimentos independientes). j Análisis de transferencia Western del nivel de proteína Ano1 durante la diferenciación de osteoclastos bajo tratamiento con HG durante 1 día, 3 días o 5 días. k Análisis QRT-PCR del nivel de ARNm de Ano1 durante la diferenciación de osteoclastos bajo tratamiento con MG durante 1 día, 3 días o 5 días. (n = 3 experimentos independientes). l Análisis de transferencia Western del nivel de proteína Ano1 durante la diferenciación de osteoclastos bajo tratamiento con MG durante 1 día, 3 días o 5 días. Todos los datos son la media ± sem El análisis estadístico con más de dos grupos se realizó con un análisis de varianza de dos vías (ANOVA) con la prueba post-hoc de Šídák para determinar las diferencias de grupo. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Estos resultados sugirieron que la fuerza mecánica afectó la actividad de los osteoclastos. Nuestro estudio anterior encontró que Ano1 juega un papel esencial en la actividad de los osteoclastos. Las características del mapa crio-EM de Ano1 y la similitud estructural de Ano1 con OSCA mecanosensible nos llevaron a probar si Ano1 estaba involucrado en la respuesta de los osteoclastos a la estimulación mecánica. Bajo el tratamiento con FSS o HG, los niveles de Ano1 en los osteoclastos disminuyeron significativamente (Fig. 1g-j). Cuando se sometió al tratamiento con MG, los niveles de Ano1 aumentaron significativamente en los osteoclastos (Fig. 1k, l). Estos resultados sugirieron que Ano1 está asociado con los cambios en las actividades de los osteoclastos inducidos por la estimulación mecánica.

Para determinar si Ano1 medió el papel de inhibición de la carga mecánica en osteoclastos, aislamos osteoclastos de ratones knockout Ano1 condicionales específicos de osteoclastos (Ctsk-Cre;Ano1fl/fl). Los resultados mostraron que las actividades de los osteoclastos Ctsk-Cre; Ano1fl / fl fueron significativamente más bajas que las de los osteoclastos Ano1fl / fl (Fig. 2a-e). Sometimos a los osteoclastos Ano1fl/fl y Ctsk-Cre;Ano1fl/fl a FSS durante 30 min por día durante 2 días y HG durante 2 días, respectivamente. El nivel de ARNm de Ano1 disminuyó en un 34,53 % y el nivel de proteína de Ano1 disminuyó en un 47,8 % después del tratamiento con FSS en los osteoclastos Ano1fl/fl, pero no hubo cambios significativos en los osteoclastos Ctsk-Cre;Ano1fl/fl (Fig. 2a, b ). El tratamiento con FSS condujo a una reducción del 40,7% en el número de células multinucleadas TRAP+ y disminuyó significativamente la expresión de NFATc1, Acp5, Ctsk y Mmp9 en los osteoclastos Ano1fl/fl (Fig. 2c-e). Se sabe que los residuos de aminoácidos conservados E702 y E705 son dos sitios clave para la activación del canal dependiente de Ca2+, que son importantes para la actividad de Ano1. Para determinar si el sitio de unión del calcio desempeña un papel clave en la estimulación mecánica mediada por Ano1, se transfectaron osteoclastos Ctsk-Cre;Ano1fl/fl con vector, Ano1 de tipo salvaje (Ano1) o Ano1 mutante (E702/E705Q), y luego se trataron con FSS. Encontramos que los osteoclastos Ctsk-Cre;Ano1fl/fl no respondieron a FSS, Ano1 de tipo salvaje puede rescatar la respuesta de los osteoclastos Ctsk-Cre;Ano1fl/fl a FSS, pero no Ano1 con mutantes de sitios de unión a Ca2+ (Fig. 2f) . De manera similar, el tratamiento con HG dio como resultado una disminución tanto en el ARNm de Ano1 como en los niveles de proteína (Fig. 3a, b), y una reducción del 22,5% en el número de osteoclastos en los osteoclastos Ano1fl/fl, pero no en los osteoclastos Ctsk-Cre;Ano1fl/fl ( Fig. 3c, d). En consecuencia, las expresiones de NFATc1, Acp5, Ctsk y Mmp9 también se inhibieron en los osteoclastos Ano1fl/fl, pero no en los osteoclastos Ctsk-Cre; Ano1fl/fl (Fig. 3e). Los osteoclastos Ctsk-Cre;Ano1fl/fl tampoco respondieron a HG, Ano1 de tipo salvaje puede rescatar la respuesta de los osteoclastos Ctsk-Cre;Ano1fl/fl a HG, pero no Ano1 con mutantes de sitios de unión a Ca2+ (Fig. 3f). Estos datos sugieren que la carga mecánica mediada por Ano1 indujo la reducción de la actividad de los osteoclastos.

un análisis QRT-PCR del nivel de ARNm de Ano1 en osteoclastos Ano1fl/fl y Ctsk-Cre;Ano1fl/fl después del tratamiento con Ctrl o FSS (12 dyn/cm2, 30 min/día) durante 2 días. (n = 3 experimentos independientes). b Análisis de transferencia Western del nivel de proteína Ano1 en osteoclastos Ano1fl/fl y Ctsk-Cre;Ano1fl/fl después del tratamiento con Ctrl o FSS (izquierda). La cuantificación del nivel de proteína Ano1 en osteoclastos (derecha). (n = 3 experimentos independientes). c Imágenes representativas de la tinción TRAP en osteoclastos Ano1fl/fl y Ctsk-Cre;Ano1fl/fl después del tratamiento con Ctrl o FSS (12 dyn/cm2, 30 min/día) durante 2 días. Barra de escala, 200 μm. d Cuantificación del número de células multinucleadas por cm2. (n = 89–231, de tres experimentos independientes). e Análisis QRT-PCR de los niveles de ARNm de NFATc1, Acp5, Ctsk y Mmp9 en osteoclastos Ano1fl/fl y Ctsk-Cre;osteoclastos Ano1fl/fl después del tratamiento con Ctrl o FSS durante 2 días. (n = 3 experimentos independientes). f Análisis QRT-PCR de los niveles de ARNm de NFATc1, Acp5, Ctsk y Mmp9 en osteoclastos aislados de ratones Ctsk-Cre;Ano1fl/fl. Los osteoclastos se transfectaron con NC, WT Ano1 o Ano1 mutante (E702/705Q) y se trataron con o sin FSS durante 2 días. (n = 3 experimentos independientes) *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

un análisis QRT-PCR del nivel de ARNm de Ano1 en osteoclastos Ano1fl/fl y Ctsk-Cre;Ano1fl/fl después del tratamiento con Ctrl o HG (4 g) durante 2 días. (n = 3 experimentos independientes). b Análisis de transferencia Western del nivel de proteína Ano1 en osteoclastos Ano1fl/fl y Ctsk-Cre;Ano1fl/fl después del tratamiento con Ctrl o HG (izquierda). La cuantificación del nivel de proteína Ano1 en osteoclastos (derecha). (n = 3 experimentos independientes). c Imágenes representativas de la tinción TRAP en osteoclastos Ano1fl/fl y Ctsk-Cre;Ano1fl/fl después del tratamiento con Ctrl o HG (4 g) durante 2 días. Barra de escala, 200 μm. d Cuantificación del número de células multinucleadas por cm2. (n = 109–312, de tres experimentos independientes). e Análisis QRT-PCR de los niveles de ARNm de NFATc1, Acp5, Ctsk y Mmp9 en osteoclastos Ano1fl/fl y Ctsk-Cre;Ano1fl/fl después del tratamiento con Ctrl o HG. (n = 3 experimentos independientes). f Análisis QRT-PCR de los niveles de ARNm de NFATc1, Acp5, Ctsk y Mmp9 en osteoclastos aislados de ratones Ctsk-Cre;Ano1fl/fl. Los osteoclastos se transfectaron con NC, WT Ano1 o Ano1 mutante (E702/705Q) y se trataron con o sin HG durante 2 días. (n = 3 experimentos independientes) *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Para determinar si Ano1 en el osteoclasto está involucrado en la respuesta a la carga mecánica in vivo, cargamos la tibia izquierda de ratones hembra Ctsk-Cre;Ano1fl/fl y Ano1fl/fl de 16 semanas de edad con una tensión máxima de +1200 μɛ en la mitad del eje30 . La tinción de TRAP mostró que la carga mecánica durante 2 semanas redujo Oc.S/BS y N.Oc/B.Pm de la tibia en ratones Ano1fl/fl pero no en ratones Ctsk-Cre;Ano1fl/fl (Figura complementaria 3a, b) La expresión de NFATc1, Acp5, Ctsk y Mmp9 disminuyó específicamente en el hueso de los ratones Ano1fl/fl tratados con carga mecánica, pero no en los ratones Ctsk-Cre;Ano1fl/fl (Fig. 3c, d complementarias). Estos resultados sugieren que Ano1 en los osteoclastos juega un papel importante en la respuesta del hueso a la carga mecánica.

Para determinar si Ano1 mediaba la respuesta de los osteoclastos a la descarga mecánica, los osteoclastos de ratones Ano1fl/fl y Ctsk-Cre;Ano1fl/fl se sometieron a un tratamiento de descarga. Después del tratamiento con MG durante 2 días, los niveles de ARNm y proteína de Ano1 aumentaron significativamente en 2,7 veces y 2 veces en los osteoclastos Ano1fl/fl, respectivamente, pero no en los osteoclastos Ctsk-Cre;Ano1fl/fl (Fig. 4a, b). El tratamiento con MG provocó un aumento de 2 veces en el número de células multinucleadas TRAP+ y aumentó significativamente la expresión de genes marcadores de osteoclastos en los osteoclastos Ano1fl/fl, pero no en los osteoclastos Ctsk-Cre;Ano1fl/fl (Fig. 4c-e). De manera similar, Ano1 de tipo salvaje puede rescatar la respuesta de los osteoclastos Ctsk-Cre; Ano1fl / fl a MG, pero no Ano1 con mutantes de sitios de unión de Ca2 + (Fig. 4f). Estos datos sugieren que la eliminación de Ano1 en osteoclasto elimina la descarga mecánica inducida por el mejora de la actividad de los osteoclastos.

un análisis QRT-PCR del nivel de ARNm de Ano1 en osteoclastos Ano1fl/fl y Ctsk-Cre;Ano1fl/fl después del tratamiento con Ctrl o MG durante 2 días. (n = 3 experimentos independientes). b Análisis de transferencia Western del nivel de proteína Ano1 en osteoclastos Ano1fl/fl y Ctsk-Cre;Ano1fl/fl después del tratamiento con Ctrl o MG durante 2 días (izquierda). La cuantificación del nivel de proteína Ano1 en osteoclastos (derecha). (n = 3 experimentos independientes). c Imágenes representativas de la tinción TRAP en osteoclastos Ano1fl/fl y Ctsk-Cre;Ano1fl/fl después del tratamiento con Ctrl o MG durante 2 días. Barra de escala, 200 μm. d Cuantificación del número de células multinucleadas por cm2. (n = 130–453, de seis experimentos independientes). e Análisis QRT-PCR de los niveles de ARNm de NFATc1, Acp5, Ctsk y Mmp9 en osteoclastos Ano1fl/fl y Ctsk-Cre;osteoclastos Ano1fl/fl después del tratamiento con Ctrl o MG. (n = 3 experimentos independientes). f Análisis QRT-PCR de los niveles de ARNm de NFATc1, Acp5, Ctsk y Mmp9 en osteoclastos aislados de ratones Ctsk-Cre;Ano1fl/fl. Los osteoclastos se transfectaron con NC, WT Ano1 o Ano1 mutante (E702/705Q) y se trataron con o sin MG durante 2 días. (n = 3 experimentos independientes). Todos los datos son la media ± sem El análisis estadístico con más de dos grupos se realizó con un análisis de varianza de dos vías (ANOVA) con la prueba post-hoc de Šídák para determinar las diferencias de grupo. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Basándonos en las características de Ano1 como canal de cloruro, investigamos los cambios del nivel citoplasmático de Cl− en osteoclastos en respuesta a la estimulación mecánica. Usamos un sensor de Cl- (la sonda fluorescente, MQAE), la intensidad de fluorescencia de este sensor está inversamente relacionada con la concentración de Cl- intracelular, y una disminución en la intensidad de fluorescencia se correlaciona con un aumento en el nivel citoplasmático de Cl-31. Curiosamente, cuando se sometió al tratamiento con FSS y HG, la intensidad de fluorescencia del sensor de Cl− se redujo significativamente en un 46,5 % y un 42,4 % por un aumento en la concentración intracelular de Cl− en los osteoclastos Ano1fl/fl, pero no en los Ctsk-. Osteoclastos Cre;Ano1fl/fl (Fig. 5a, b). Sin embargo, cuando se sometió al tratamiento con MG, la intensidad de fluorescencia del sensor de Cl− aumentó, pero no en los osteoclastos Ctsk-Cre;Ano1fl/fl (Fig. 5c). Estos resultados indicaron que la carga mecánica podría aumentar los niveles intracelulares de Cl- y la descarga disminuir los niveles intracelulares de Cl- en el osteoclasto, que fue mediado por Ano1.

Medición de la concentración de cloruro intracelular en osteoclastos. Todas las células se tiñeron con MQAE 5 mM. a Imágenes fluorescentes representativas de osteoclastos Ano1fl/fl y Ctsk-Cre;Ano1fl/fl después del tratamiento con Ctrl o FSS (12 dyn/cm2, 30 min/día) durante 2 días (izquierda). Barra de escala, 100 μm. La intensidad de fluorescencia relativa de los osteoclastos (derecha). (n = 3 experimentos independientes). b Imágenes fluorescentes representativas de osteoclastos Ano1fl/fl y Ctsk-Cre;Ano1fl/fl después del tratamiento con Ctrl o HG (4 g) durante 2 días (izquierda). Barra de escala, 100 μm. La intensidad de fluorescencia relativa de los osteoclastos (derecha). (n = 3 experimentos independientes). c Imágenes fluorescentes representativas de osteoclastos Ano1fl/fl y Ctsk-Cre;Ano1fl/fl después del tratamiento con Ctrl o MG durante 2 días (izquierda). Barra de escala, 100 μm. La intensidad de fluorescencia relativa de los osteoclastos (derecha). (n = 3 experimentos independientes). Todos los datos son la media ± sem El análisis estadístico con más de dos grupos se realizó con un análisis de varianza de dos vías (ANOVA) con la prueba post-hoc de Šídák para determinar las diferencias de grupo. ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Nuestro estudio anterior encontró que Ano1 era necesario para la activación de CaMKIVCreb mediada por RANKL durante la osteoclastogénesis. Para determinar si Ano1 media la respuesta de los osteoclastos a la estimulación mecánica a través de la vía de señalización de CaMKIV-Creb, probamos el efecto de la carga y descarga mecánica en la fosforilación de CaMKIV y Creb. Los resultados mostraron que la fosforilación de CaMKIV y Creb disminuyó, lo que estuvo acompañado por una regulación a la baja de NFATc1 en los osteoclastos Ano1fl/fl después del tratamiento con FSS o HG, pero no hubo cambios en los osteoclastos Ctsk-Cre;Ano1fl/fl (Fig. .6a–h). La fosforilación de CaMKIV y Creb, y los niveles de proteína NFATc1 aumentaron en los osteoclastos Ano1fl/fl después del tratamiento con MG, pero no hubo cambios en los osteoclastos Ctsk-Cre;Ano1fl/fl entre el grupo Ctrl y MG (Fig. 6i– l). Estos resultados indicaron que la señalización de CaMKIV-Creb-NFATc1 está involucrada en la estimulación mecánica mediada por Ano1 en la actividad de los osteoclastos.

un análisis de transferencia Western de los niveles de proteína p-CaMKIV, CaMKIV, p-Creb, Creb y NFATc1 en osteoclastos Ano1fl/fl y Ctsk-Cre;Ano1fl/fl con tratamiento Ctrl o FSS (12 dyn/cm2, 30 min/día) para 2 días. b–d La cuantificación de los niveles de proteína p-CaMKIV, p-Creb y NFATc1 en osteoclastos. El nivel de proteína p-CaMKIV se normalizó a CaMKIV, el nivel de proteína p-Creb se normalizó a Creb y el nivel de proteína NFATc1 se normalizó a Gapdh. (n = 3 experimentos independientes). e Análisis de transferencia Western de los niveles de proteína p-CaMKIV, CaMKIV, p-Creb, Creb y NFATc1 en osteoclastos Ano1fl/fl y Ctsk-Cre;Ano1fl/fl con tratamiento Ctrl o HG (4 g) durante 2 días. f – h La cuantificación de los niveles de proteína p-CaMKIV, p-Creb y NFATc1 en osteoclastos. El nivel de proteína p-CaMKIV se normalizó a CaMKIV, el nivel de proteína p-Creb se normalizó a Creb y el nivel de proteína NFATc1 se normalizó a Gapdh. (n = 3 experimentos independientes). i Análisis de transferencia Western de los niveles de proteína p-CaMKIV, CaMKIV, p-Creb, Creb y NFATc1 en osteoclastos Ano1fl/fl y Ctsk-Cre;Ano1fl/fl con tratamiento Ctrl o MG durante 2 días. j–l La cuantificación de los niveles de proteína p-CaMKIV, p-Creb y NFATc1 en osteoclastos. El nivel de proteína p-CaMKIV se normalizó a CaMKIV, el nivel de proteína p-Creb se normalizó a Creb y el nivel de proteína NFATc1 se normalizó a Gapdh. (n = 3 experimentos independientes). Todos los datos son la media ± sem. El análisis estadístico se realizó con un análisis de varianza (ANOVA) de dos vías con la prueba post-hoc de Šídák para determinar las diferencias de grupo. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Para determinar si Ano1 media la pérdida ósea inducida por la descarga mecánica, utilizamos el modelo de suspensión de las patas traseras (HS) para examinar los cambios óseos de las patas traseras en respuesta a la descarga con soporte de peso. Los ratones Ano1fl/fl y Ctsk-Cre;Ano1fl/fl de tres meses de edad fueron sometidos a HS durante 28 días. Los niveles de ARNm y proteína de Ano1 aumentaron significativamente en tejidos óseos de ratones Ano1fl/fl sometidos a HS (Fig. 7a, b). El análisis de micro-CT mostró que la masa ósea trabecular y los parámetros relacionados con la arquitectura, incluida la relación entre el volumen óseo y el volumen tisular (BV/TV), el número trabecular (Tb.N) y el espesor trabecular (Tb.Th), se redujeron significativamente y el espaciado trabecular (Tb.Sp) aumentó en consecuencia en los ratones Ano1fl/fl después del tratamiento con HS (Fig. 7c, d). Los ratones Ctsk-Cre;Ano1fl/fl sometidos a HS mostraron una masa ósea trabecular, BV/TV, Tb.N y Tb.Th mucho mayor que la de los ratones Ano1fl/fl sometidos a HS. En consecuencia, Tb.Sp fue mucho menor en los ratones Ctsk-Cre;Ano1fl/fl que en los ratones de control (Fig. 7c, d). A continuación, analizamos los cambios correspondientes en la función de los osteoclastos después del tratamiento con HS. La tinción de TRAP mostró una actividad de osteoclastos obviamente aumentada en los ratones Ano1fl/fl sometidos a HS. Sin embargo, HS indujo solo un pequeño aumento en la actividad TRAP en ratones Ctsk-Cre;Ano1fl/fl, que fue mucho más débil que el observado en ratones Ano1fl/fl (Fig. 7e). La superficie de osteoclastos por superficie ósea (Oc.S/BS) y el número de osteoclastos por perímetro óseo (N.Oc/B.Pm) en la tibia proximal de ratones Ctsk-Cre;Ano1fl/fl sometidos a HS fueron mucho más bajos que en los ratones Ano1fl/fl (Fig. 7f). En consecuencia, el nivel de CTX-1 mostró un aumento significativo en el suero de los ratones Ano1fl/fl, mientras que hubo un pequeño aumento en los ratones Ctsk-Cre;Ano1fl/fl (Fig. 7g). El análisis QRT-PCR mostró que los niveles de ARNm de NFATc1, Acp5, Ctsk y Mmp9 se redujeron significativamente en el tejido óseo de los ratones Ctsk-Cre;Ano1fl/fl sometidos a HS en comparación con los ratones de control Ano1fl/fl sometidos a HS (Fig. 7h) . Para verificar el cambio en la formación ósea en ratones Ctsk-Cre;Ano1fl/fl y ratones Ano1fl/fl después del tratamiento con HS, inyectamos calceína por vía intraperitoneal en ratones 10 días y 2 días antes de la eutanasia para etiquetar la formación de hueso nuevo. Después del tratamiento con HS, la tasa de aposición mineral (MAR) y la tasa de formación de hueso por superficie ósea (BFR/BS) en las tibias de los ratones Ano1fl/fl se redujeron en un 31 % y un 17 %, respectivamente. Sus niveles en las tibias de los ratones Ctsk-Cre;Ano1fl/fl después del tratamiento con HS disminuyeron en un 21 % y un 4 % en comparación con el grupo Ctrl, respectivamente (Fig. 4a, b complementarias).

a, b Análisis QRT-PCR del nivel de ARNm de Ano1 y análisis de transferencia Western del nivel de proteína Ano1 en tejidos óseos de ratones Ano1fl/fl y Ctsk-Cre;Ano1fl/fl con tratamiento Ctrl o suspensión de extremidades traseras (HS). (n = 6 para cada grupo). c Imágenes representativas que muestran la arquitectura trabecular tridimensional según lo determinado por la reconstrucción por micro-CT de los fémures distales de los grupos de ratones indicados. Barra de escala, 0,5 mm. d Mediciones de micro-CT para volumen óseo por volumen de tejido (BV/TV), número trabecular (Tb.N), grosor trabecular (Tb.Th) y espaciado trabecular (Tb.Sp) en los fémures distales de los grupos de ratones indicados . (n = 6 para cada grupo). e Imágenes representativas de la tinción TRAP de la tibia proximal de los grupos de ratones indicados. Barra de escala, 50 μm. f Análisis de histomorfometría de las imágenes para el número de osteoclastos por perímetro óseo (N.Oc/B.Pm) y superficie de osteoclastos por superficie ósea (Oc.S/BS). (n = 6 para cada grupo). g Análisis ELISA del nivel de proteína CTX-1 en suero de los grupos de ratones indicados. (n = 6 para cada grupo). h Análisis QRT-PCR de los niveles de ARNm de NFATc1, Acp5, Ctsk y Mmp9 en tejidos óseos recogidos de los grupos de ratones indicados. (n = 6 para cada grupo). El análisis estadístico con más de dos grupos se realizó con un análisis de varianza de dos vías (ANOVA) con la prueba post-hoc de Šídák para determinar las diferencias entre los grupos. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

En este estudio, demostramos que Ano1 es un canal mecanosensible no identificado previamente en los osteoclastos. Encontramos que la función de los osteoclastos está regulada por el tratamiento mecánico, que se acompaña con los cambios en los niveles de Ano1. En condiciones de tensión de cizallamiento de fluidos de 12 dyn/cm2 o de hipergravedad de 4 g, se inhibió la actividad de los osteoclastos y disminuyó la expresión de Ano1. Por el contrario, la microgravedad simulada promueve la actividad de los osteoclastos y aumenta los niveles de Ano1. Aquí, identificamos las funciones de Ano1 como un regulador importante en las respuestas de los osteoclastos al estrés mecánico (Fig. 8). Además, en condiciones de carga mecánica, aumentó la concentración de iones de cloruro intracelular y se inhibió la señal de calcio. La descarga mecánica, por otro lado, reduce la concentración de iones de cloruro intracelular y promueve la señal de calcio. Los niveles intracelulares de Cl− son necesarios para el mantenimiento de la acidificación extracelular. Ano1 knockout o sitios de unión a Ca2+ mutantes de Ano1 en osteoclastos no respondieron a la carga o descarga mecánica. Estos hallazgos sugieren que Ano1 funciona como un sensor mecánico en el osteoclasto a través de sus actividades de canal reguladas por calcio.

Ano1 funciona como un sensor mecánico en el osteoclasto a través de sus actividades de canal reguladas por calcio.

Durante la última década, se sabía que los osteoblastos y los osteocitos eran los principales respondedores a la estimulación mecánica en el tejido óseo. Se ha considerado que el cambio en la función de los osteoclastos bajo diferentes estímulos mecánicos se atribuye en gran medida a los osteoblastos y los osteocitos. La carga mecánica aumenta la función de los osteoblastos y los osteocitos8,32,33. La osteoclastogénesis y la función de los osteoclastos están reguladas por la secreción de RANKL de los osteoblastos y los osteocitos34,35. Sin embargo, en condiciones de microgravedad y microgravedad simulada, se suprime la función de los osteoblastos, se reduce la masa ósea y el contenido mineral, y se deterioran las microestructuras corticales y trabeculares del hueso32,36. Sin embargo, la función de los osteoclastos sigue aumentando en condiciones de descarga ósea, tanto en la Tierra como en el espacio. Esto plantea la cuestión de qué factores intrínsecos permiten que los osteoclastos sean sensibles a los estímulos mecánicos, independientemente de los cambios en los osteoblastos o los osteocitos. Los canales iónicos son proteínas multiméricas formadoras de poros ubicadas en la membrana plasmática. Tienen la capacidad de abrirse y cerrarse en respuesta a diferentes señales mecánicas37,38,39,40,41,42. Existe evidencia de que la FSS puede suprimir la diferenciación de osteoclastos a través de cambios morfológicos y alteraciones en la expresión génica. Un estudio in vitro anterior mostró que hay dos tipos de canales de transducción mecánica en respuesta a la estimulación de FSS durante la diferenciación de osteoclastos. Específicamente, la molécula 1 de interacción estromal de la proteína transmembrana tipo 1A (STIM1) media la oscilación [Ca2+]i inducida por FSS durante la etapa temprana de la diferenciación de osteoclastos, mientras que el miembro de la familia del potencial receptor transitorio (TRP) TRPV4 juega un papel importante en el Ca2+ inducido por FSS flujo y oscilación de [Ca2+]i en la etapa tardía de la diferenciación de osteoclastos43. En nuestro estudio, encontramos que la estimulación de FSS y HG inhibe la expresión de Ano1 y la actividad del canal al aumentar el [Cl−]i intracelular e inhibir la activación de la vía descendente de Ca2+ en los osteoclastos. Por el contrario, la estimulación de MG promueve la expresión de Ano1 y la actividad del canal al reducir el [Cl−]i intracelular y activar la vía descendente de activación de Ca2+.

Recientemente, se resolvió la estructura crio-EM de Ano1, lo que reveló su homología estructural con canales mecanosensibles como OSCA1.2 y otros miembros de la familia OSCA41. Tienen arquitecturas diméricas similares, estructuras de dominio transmembrana y ubicaciones de poros26. Estos resultados sugieren un papel potencial de Ano1 en la mecanosensación. Aquí, encontramos que la respuesta de los osteoclastos a la estimulación mecánica depende de Ano1. Los niveles y la actividad de Ano1 subrayan el efecto de la estimulación mecánica sobre los osteoclastos. Además, la expresión de Ano1 está modulada por diferentes estímulos mecánicos. La carga mecánica disminuye los niveles de Ano1, mientras que la descarga mecánica aumenta los niveles de Ano1. La eliminación de Ano1 en osteoclastos reduce sustancialmente su sensibilidad a la estimulación mecánica. Sin embargo, para determinar Ano1 como un mecanosensor, los cambios de arquitectura de los canales de Ano1 bajo estimulación mecánica deben dilucidarse aún más.

En conjunto, nuestros hallazgos establecieron que las actividades de los osteoclastos obviamente se ven afectadas por el estrés mecánico, que se acompaña de niveles alterados de Ano1, concentración de Cl- intracelular y señalización de Ca2+. Los ratones knockout para Ano1 específicos de osteoclastos son resistentes a la pérdida ósea inducida por la descarga al atenuar la respuesta de los osteoclastos. Estos resultados demuestran que Ano1 es un factor intrínseco que confiere a los osteoclastos la capacidad de responder a la estimulación mecánica. Los inhibidores específicos de Ano1 son un enfoque prometedor para contrarrestar la pérdida ósea.

Los ratones Ano1 floxed (Ano1fl/fl, un generoso regalo del Dr. Min-Sheng Zhu)44 se cruzaron con la cepa Ctsk-Cre (un generoso regalo del Dr. Weiguo Zou)45 para generar ratones Ctsk-Cre;Ano1fl/fl . Todos los ratones analizados se mantuvieron en el fondo C57BL/6. Los animales se criaron y mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos (SPF) en el Edificio de Investigación Animal del Centro de Investigación y Entrenamiento de Astronautas de China (ciclos de 12 h de luz, 12 h de oscuridad, temperatura controlada a 21 ± 2 °C con libre acceso a alimentos y agua). Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por los Comités de Ética Animal y Seguridad Experimental del Centro de Investigación y Entrenamiento de Astronautas de China (Número de referencia: ACC-IACUC-2022-002).

Se obtuvieron macrófagos derivados de médula ósea (BMM) de ratón a partir de tibias y fémures de ratones macho de 6 a 8 semanas de edad. Las células de la médula ósea se lavaron y recolectaron con medio esencial mínimo α completo (MEM α, suero bovino fetal al 10 % [FBS] y penicilina/estreptomicina). Las células se cultivaron con medio α-MEM completo en presencia de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF; 10 ng/ml, R&D Systems) durante 1 día. Las células en suspensión se recogieron y se inocularon en un portaobjetos de vidrio o cultivo flash. Las células se cultivaron en medio completo inducido con 30 ng/ml de M-CSF y 50 ng/ml de activador del receptor del ligando kB del factor nuclear (RANKL; R&D Systems). El medio de cultivo se reemplazó cada 2 días.

La tinción de TRAP se realizó utilizando un kit de fosfatasa ácida según las instrucciones del fabricante (Sigma-Aldrich, catálogo n.º 387). Las células cultivadas durante un período determinado se lavaron con solución tampón de fosfato (PBS) y se fijaron con formaldehído al 4% durante 5 min a temperatura ambiente y se enjuagaron a fondo en PBS. Las células se incubaron en solución de tinción TRAP a 37 °C durante 0,5-1 h protegidas de la luz. Tras la eliminación de la solución TRAP, las placas se lavaron tres veces con agua destilada. Las células multinucleadas positivas para TRAP que contenían tres o más núcleos se contaron bajo un microscopio invertido (Nikon).

Las tibias de los ratones se desollaron y se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 48 h. Las tibias se descalcificaron con EDTA al 10 % durante 10 a 15 días, luego se deshidrataron y se incluyeron en parafina. Se prepararon secciones de 5 a 7 μm en un micrótomo de rotación. Las secciones se desparafinaron y se incubaron con solución de tinción TRAP a 37 °C durante 1 h protegidas de la luz. Se usó verde de metilo para la contratinción. Las imágenes se adquirieron con microscopio y los análisis estadísticos se realizaron con el sistema de análisis BioquantOsteo.

El ARN total se extrajo de células o tejidos utilizando el reactivo TRIzol de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa se realizó con 0,5 µg de ARN total en un volumen total de 10 µl por reacción. El ARN se transcribió inversamente en ADNc con el kit de reactivos PrimeScript RT (Takara, RR037A) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. PCR cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR) usando un TB Green™ Premix Ex Taq™ II (Takara, RR820A). Gapdh se utilizó como control de normalización para el ARNm. Todos los cebadores fueron fabricados por BGI (Beijing, China). Se utilizaron los siguientes cebadores: Gapdh F: ACATCATCCCTGCATCCACTG, R: TCATTGAGAGCA ATGCCAGC; NFATc1 F: ACGCTACAGCTGTTCATTGG, R: CTTTGGTGTTGGACAGGATG; Acp5 F: GCGACCATTGTTAGCCACATACG, R: CGTTGATGTCGCACAGAGGGAT; Mmp9 F: GCTGACTACGATAAGGACGGCA, R: GCGGCCCTCAAAGATGAACGG; Ctsk F: GCGTTGTTCTTATTCCGAGC, R: CAGCAGAGGTGTGTACTATG; Ano1 F: CCCGTGCCAGTCACCTTTTT, R: TCATCTGCTTCCGTTTCCAGT.

Las células se lisaron en tampón de lisis (tampón RIPA, PMSF 1 mM, cóctel inhibidor de fosfatasa y cóctel inhibidor de proteasa) en hielo durante 15 min. Los tejidos óseos se trituraron con un mortero en nitrógeno líquido y se lisaron en tampón de lisis a 4 °C durante 30 min. Las fracciones de proteína se recogieron por centrifugación a 12 000 × g, 4 °C durante 10 min y luego se sometieron 10 mg de lisados ​​a SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de filtro de nitrocelulosa (NC). Las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5% y se incubaron con anticuerpos específicos durante la noche. Los anticuerpos utilizados fueron enumerados: conejo anti-NFATc1 (1:1000, abclonal, A1539), conejo anti-Ano1 (1:1000, abclonal, A10498), conejo anti-p-CaMKIV anticuerpo (1:1000, ImmunoWay, YP0043 ), anticuerpo anti-CaMKIV de conejo (1:1000, tecnología de señalización celular, 4032), anticuerpo anti-Creb de conejo (1:1000, tecnología de señalización celular, 9197), anticuerpo anti-p-Creb de conejo (1:1000, tecnología de señalización celular Technology, 9198), anticuerpo anti-Gapdh de conejo (1:5000, Abways, AB0036).

El flujo de fluido se aplicó a las células en una cámara de flujo de placas paralelas utilizando un bucle de flujo cerrado. Los osteoclastos se sembraron a una densidad de 4 × 106 células en cubreobjetos de vidrio de 22 × 26 mm y se cultivaron en medio α-MEM con RANKL y M-CSF durante 3 días. Los cubreobjetos se colocaron en la cámara de flujo de placas paralelas y se trataron con 12 dyn/cm2 FSS 30 min/día, el aparato se mantuvo a 37 ˚C durante todo el experimento. La correlación entre FSS y el caudal se calculó mediante la ecuación: τ = 6 μQ/bh2, donde Q es el caudal (cm3/s), μ es la viscosidad del medio de flujo (0,01 dinas/cm2), h es la altura del canal (0,05 cm), b es el ancho de la rendija (2,5 cm) y τ es el esfuerzo cortante de la pared (dina/cm2). La cámara de flujo de placas paralelas se ha descrito anteriormente8,46.

Se utilizó una centrífuga de hipergravedad para detectar los efectos de la hipergravedad en los osteoclastos. En este estudio, los osteoclastos se sembraron a una densidad de 107 células en un matraz de cultivo celular de 12,5 cm2 y se cultivaron en medio α-MEM con RANKL (50 ng/ml) y M-CSF (30 ng/ml) durante 3 días. Para evitar la presencia de burbujas de aire, los matraces se llenaron con medio de cultivo. Los matraces se fijaron con cuidado al panel giratorio de la centrífuga de hipergravedad y se giraron a una velocidad constante de 4 g en condiciones de hipergravedad a 37 °C. Para el control, las células se cultivaron de la misma manera pero sin clinorotación (1 g). La centrífuga de hipergravedad ha sido descrita previamente32.

Utilizamos un clinóstato 2D para simular la microgravedad. El clinostato 2D fue diseñado y proporcionado por el Centro de Investigación y Capacitación de Astronautas de China (Beijing, China). La rotación provoca un vector de gravedad que no es reconocible por las células. Por lo tanto, el dispositivo evita que las células sientan la gravedad. Los métodos de procesamiento de los osteoclastos siguieron a la descripción de la microgravedad simulada por rotación. Los matraces se fijaron con cuidado al panel giratorio del sistema clinostat y se giraron a una velocidad constante de 30 rpm/min para simular la microgravedad (0,01 g). Para el control, las células se cultivaron de la misma manera pero sin clinorrotación (1 g). El clinostato 2D ha sido descrito previamente8,32.

Los osteoclastos se incubaron con MQAE 5 mM (Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., China) durante 30 minutos y luego se enjuagaron cinco veces con PBS. Las imágenes de fluorescencia celular se realizaron utilizando un microscopio de barrido láser confocal (CLSM, Leica SP5, Alemania) con luz de excitación de 350 nm y luz de emisión de 460 nm. Los cambios en [Cl-]i fueron representados por los cambios en la intensidad de fluorescencia. La intensidad de fluorescencia promedio de cada celda se analizó mediante el software Image J.

El procedimiento de descarga de las patas traseras se logró mediante la suspensión de la cola. Todos los ratones macho se mantuvieron en condiciones estándar de alojamiento de animales. Los ratones macho Ano1fl/fl y Ctsk-Cre;Ano1fl/fl de 3 meses se enjaularon individualmente y se suspendieron por la cola usando una tira de cinta quirúrgica adhesiva unida a una cadena que colgaba de una polea. Los ratones se suspendieron en un ángulo de 30˚ con respecto al suelo con solo las extremidades anteriores tocando el suelo, lo que permitió que los ratones se movieran y accedieran libremente a la comida y el agua. Los ratones se sometieron a descarga de las patas traseras a través de la suspensión de la cola durante 28 días. Inyectamos calceína (30 mg/kg, sigma) por vía intraperitoneal en ratones 10 días y 2 días antes de la eutanasia para marcar la formación de hueso nuevo. Después de la eutanasia, se recogieron el suero y los tejidos óseos completos. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por los Comités de Ética Animal y Seguridad Experimental del Centro de Investigación y Entrenamiento de Astronautas de China.

De acuerdo con un protocolo30, cargamos la tibia izquierda de ratones hembra Ctsk-Cre;Ano1fl/fl y Ano1fl/fl de 16 semanas de edad con una tensión máxima de +1200 με en el eje medio usando un Electroforce BOSE 5100. La tibia izquierda de cada El ratón se cargó durante cinco días consecutivos a la semana durante 2 semanas (días 1 a 5 y días 8 a 12), y la carga se aplicó en 1200 ciclos con una forma de onda triangular de 4 Hz y un tiempo de descanso de 0,1 s entre cada ciclo. Después de la eutanasia, se recolectaron tejidos óseos el día 15.

Los fémures de ratón fueron desollados y fijados en etanol al 75%. Para el fémur distal y la tibia proximal, se escaneó ex vivo toda la esponjosa secundaria del fémur distal y la tibia proximal de cada ratón utilizando un sistema microCT (mCT40, SCANCO MEDICAL, Suiza). Brevemente, se seleccionaron 80 cortes de hueso trabecular proximal a la placa de crecimiento distal para analizar el volumen óseo por volumen de tejido (BV/TV), número trabecular (Tb.N), grosor trabecular (Tb.Th) y espaciado trabecular (Tb. esp).

Los análisis se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante para las concentraciones séricas de CTX-1 con el kit ELISA CTX1 de ratón (Sangon Biotech, D721204). Este ensayo emplea la técnica de inmunoensayo enzimático sándwich. Agregue el estándar y la muestra a la microplaca que se ha recubierto previamente con el anticuerpo CTX1 anti-ratón. Después de la incubación, agregue el anticuerpo CTX1 anti-ratón conjugado con biotina. Luego se combina con estreptavidina conjugada con HRP para formar un complejo inmunológico, luego se incuba y se lava para eliminar la enzima no unida, y luego se agrega al sustrato cromogénico TMB para producir un color azul y se convierte en el amarillo final bajo la acción del ácido. Finalmente, se midió el valor de absorbancia (DO) a 450 nm. La concentración de CTX1 de ratón en la muestra fue proporcional al valor de OD. La concentración de CTX1 de ratón en la muestra se puede calcular dibujando una curva estándar.

Los experimentos basados ​​en células se realizaron al menos en tres réplicas independientes. Los animales se aleatorizaron en diferentes grupos y se usaron al menos 5 ratones para cada grupo. Los datos se presentan como media ± sem. Se usó la prueba t de Student para las evaluaciones estadísticas de las comparaciones de dos grupos. El análisis estadístico con más de dos grupos se realizó con análisis de varianza de una vía (ANOVA). Todos los análisis estadísticos se realizaron con el software Prism (Graphpad prism for windows, versión 8.0). Las diferencias se consideraron significativas en *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Los datos generados o analizados durante este estudio se proporcionan en el documento principal (Figs. 1–8) y figuras complementarias (Figs. 1–4 complementarias). Las imágenes originales de gel y transferencia se muestran en las Figs. complementarias. 5–8. Los datos de origen para los gráficos y las imágenes se pueden encontrar en los archivos complementarios de Excel (datos complementarios). Todos los recursos también están disponibles a través de los autores previa solicitud razonable.

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Agradecemos a Min-Sheng Zhu (Universidad de Nanjing, Nanjing, China) por proporcionar los ratones floxed ANO1, Weiguo Zou (Instituto de Bioquímica y Biología Celular de Shanghai, Academia de Ciencias de China, Shanghai, China) por proporcionar los ratones Ctsk-Cre. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81830061, 82192882 para Yingxian L., 82072108 para Yuheng L. y 32000879 para JL), el Proyecto de Experimento Médico Espacial del Programa Espacial Tripulado de China (HYZHXM01006) para YingxianL.

Laboratorio clave de Beijing para separación y análisis en biomedicina y productos farmacéuticos, Instituto de Tecnología de Beijing, Beijing, China

weijia sol & rongji dai

Laboratorio Estatal Clave de Fundamentos y Aplicaciones de la Medicina Espacial, Centro de Investigación y Capacitación de Astronautas de China, Beijing, China

Weijia Sun, Yuheng Li, Jianwei Li, Yingjun Tan, Xinxin Yuan, Guohui Zhong, XiaoYan Jin, Zizhong Liu, Ruikai Du, Wenjuan Xing, Dingsheng Zhao, Jinping Song, Youyou Li, Junjie Pan, Yunzhang Zhao, Qi Li y Yingxian Li

Instituto de Ortopedia, Hospital General del EPL de China, Beijing, China

Haoye Meng, Jianting Ye y Aiyuan Wang

Laboratorio de Oujiang (Laboratorio de Zhejiang para Medicina Regenerativa, Visión y Salud Cerebral), Wenzhou, Zhejiang, China

Shukuan Ling

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WS diseñó y realizó la mayoría de los experimentos, analizó los datos y preparó el manuscrito; Yuheng L. contribuyó con el análisis de μCT; JL diseñó los experimentos con animales; YT contribuyó con clinostato, centrífuga de hipergravedad e instalaciones de tensión de corte de fluidos. HM, JY y AW proporcionaron un dispositivo de carga mecánica y un sistema de análisis, GZ, XY y XJ ayudaron con el tratamiento in vivo; DZ, ZL, RDWX y JS brindaron sugerencias para la preparación del manuscrito Youyou L., JP, YZ y QL brindaron apoyo para el material experimental; SL, RD y Yingxian L. dirigieron el estudio y revisaron el artículo.

Correspondencia con Shukuan Ling, Rongji Dai o Yingxian Li.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Zhousheng Xiao y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Martina Rauner y Christina Karlsson Rosenthal.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Sun, W., Li, Y., Li, J. et al. La estimulación mecánica controla la función de los osteoclastos a través de la regulación del canal de Cl− activado por Ca2+ Anoctamin 1. Commun Biol 6, 407 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04806-1

Descargar cita

Recibido: 24 agosto 2022

Aceptado: 04 abril 2023

Publicado: 13 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04806-1

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