El silenciamiento epigenético por el complejo SMC5/6 media el VIH

Sep 15, 2023

Nature Microbiology volumen 7, páginas 2101–2113 (2022)Citar este artículo

5997 Accesos

2 citas

187 Altmetric

Detalles de métricas

Después de la entrada viral y la transcripción inversa, los provirus del VIH-1 que no logran integrarse se silencian epigenéticamente, pero el mecanismo subyacente aún no está claro. Usando una pantalla de eliminación de CRISPR/Cas9 en todo el genoma, identificamos el complejo anfitrión SMC5/6 como esencial para este silenciamiento epigenético. Mostramos que SMC5/6 se une y luego SUMOila el ADN del VIH-1 cromatinizado no integrado. La inhibición de SUMOylation, ya sea por mutagénesis puntual del componente NSMCE2 de SMC5/6, una ligasa SUMO E3, o mediante el uso del inhibidor de SUMOylation TAK-981, previene el silenciamiento epigenético, permite la transcripción del ADN del VIH-1 no integrado y rescata la replicación del ADN deficiente en integrasa. VIH-1. Finalmente, mostramos que el bloqueo de la expresión del complejo SMC5/6, o la inhibición de su actividad SUMOylation, suprime el establecimiento de infecciones latentes por VIH-1 tanto en las líneas de células T CD4+ como en las células T humanas primarias. En conjunto, nuestros datos muestran que el complejo SMC5/6 desempeña un papel directo en la mediación del establecimiento de la latencia del VIH-1 al silenciar epigenéticamente los provirus del VIH-1 competentes en integración antes de la integración.

La integración del ADN proviral en el genoma de la célula huésped es una característica definitoria del ciclo de vida retroviral que es esencial para la transcripción y replicación provirales1,2. Los inhibidores de la integrasa (IN) inhiben potentemente la replicación del VIH-13. En ausencia de IN funcional, los provirus del VIH-1 no integrados acumulan marcas epigenéticas represivas, incluida la trimetilación de lisina 9 en la histona H3 (H3K9me3), y carecen de marcas activadoras, como la acetilación de H3 (H3Ac)4,5. Si bien el silenciamiento epigenético de la transcripción del ADN del VIH-1 no integrado probablemente representa una defensa del huésped contra el ADN extraño, los mecanismos subyacentes y los factores celulares que median este efecto siguen estando incompletamente definidos6,7.

En el virus de la leucemia murina (MLV), una pantalla genómica identificó componentes del complejo del centro de silenciamiento humano (HUSH), así como la proteína de unión al ADN NP220, como críticos para el silenciamiento del ADN del MLV no integrado8. Sin embargo, el trabajo posterior9,10 no pudo detectar ningún papel del complejo HUSH o NP220 en el silenciamiento del VIH-1 no integrado. Más recientemente, una pantalla de 1217 genes humanos que se encontró que estaban regulados a la baja por la proteína Vpr del VIH-1 identificó un componente del mantenimiento estructural del complejo cromosómico (SMC) 5/6, el factor de localización del complejo SMC5/6 2 (SLF2), como crítico. para el silenciamiento del ADN del VIH-1 no integrado. Esta pantalla también mostró que otros seis componentes del complejo SMC5/6, incluidos SMC5 y 6, así como las cuatro proteínas asociadas a SMC5/6, mantenimiento no estructural de los elementos cromosómicos 1 a 4 (NSMCE1–4), pero no el SMC5/ 6 asociado al factor SLF1, también fueron críticos para el silenciamiento epigenético del ADN del VIH-1 no integrado9. Cabe destacar que se demostró previamente que el complejo SMC5/6 es degradado por la proteína no estructural HBX del virus de la hepatitis B (VHB) y, en ausencia de HBX, el ADN del VHB episomal también se silencia epigenéticamente11,12. Por lo tanto, el complejo SMC5/6 no solo participa en la replicación, recombinación y reparación cromosómica13, sino que también puede silenciar el ADN viral invasivo. Aquí buscamos determinar si el complejo SMC5/6 media el establecimiento de infecciones latentes por VIH-1.

Para identificar los factores que silencian transcripcionalmente el ADN del VIH-1 no integrado, realizamos una pantalla de eliminación de CRISPR/Cas9 en todo el genoma14 en la línea de células T CD4+ humanas CEM-SS. Transducimos un subclón de CEM-SS que expresa Streptococcus pyogenes Cas9 con una biblioteca lentiviral que expresa ~80 000 ARN de guía única (sgRNA) dirigidos a 19 114 genes humanos15. Siete días después, infectamos estas células con IN-NL-GFPΔEnv10, un derivado del VIH-1 que alberga una deleción en env, la mutación inactiva D64V16 en IN y el marco de lectura abierto de la proteína verde fluorescente (GFP) en lugar de nef. Este virus conserva copias intactas de los otros seis genes del VIH-1, incluido el vpr. A las 48 h después de la infección (hpi), las células GFP+ se recolectaron mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), los sgRNA recuperados por (reacción en cadena de la polimerasa) PCR luego se clonaron en el mismo vector lentiviral. Después de tres rondas de selección de células GFP+, los sgRNA se secuenciaron y analizaron para determinar su enriquecimiento en comparación con la biblioteca de sgRNA inicial. Como se muestra en el gráfico del volcán en la Fig. 1a, identificamos 9 genes que se enriquecieron> 16 veces y tenían un valor de P <0.0005. Estos incluyeron 3 receptores de superficie celular (LY9, OR52N2 y SSTR2) y 1 proteína motora (MYO1B) que no se analizaron más. Este análisis también recuperó 4 de los 8 componentes conocidos del complejo SMC5/6, a saber, SMC5, SMC6, SLF1 y NSMCE3, así como la proteína de reparación del ADN SWI5 (Fig. 1a).

a, Gráfica de volcán del cambio de pliegue medio de sgRNA específicos para cada gen y sus valores de P corregidos de tasa de descubrimiento falso (FDR). Se etiquetan los genes con un cambio de pliegue >16 y un valor de P <0,0005 (delineados por líneas rojas). Brevemente, los valores de P para sgRNA individuales se calcularon usando un modelo binomial negativo (NB), luego los valores de P de sgRNA ordenados se usaron para calcular los valores de P corregidos por FDR para genes individuales usando el algoritmo de agregación de rango robusto (αRRA) en MAGeCK-VISPR50,51 . Los miembros del complejo SMC5/6 están en verde (valores P corregidos por FDR: SMC5 = 7,8 × 10−7, SMC6 = 0,00033, NSMCE3 = 0,00010, SLF1 = 0,00017). b, Citometría de flujo de células WT CEM-SS y las líneas celulares de eliminación clonal indicadas a 2 ppp con un virus informador IN-NL-GFPΔEnv a una MOI de ~0,3. Se muestra un experimento representativo de 3 réplicas biológicas. c, d, citometría de flujo de células WT (c) o ΔSMC5 CEM-SS (d) a 2 ppp con virus informador IN+ NL-GFPΔEnv a una MOI de ~0,3. Se muestran experimentos representativos de 3 réplicas biológicas. e–h, Evolución temporal de la infección de las células parentales CEM-SS Cas9, o los clones ∆SMC5 y ∆SLF2 CEM-SS con IN+ o IN− NL-NLuc. e, células vivas. f, expresión NLuc codificada viralmente. g, ADN de VIH-1 total. h, expresión total de ARN de VIH-1 cuantificada en los dpi indicados. Todos los cultivos infectados con VIH-1 IN+ murieron por citopaticidad viral a los 7 ppp. Los niveles de ADN y ARN se cuantificaron mediante qPCR y se normalizaron a células CEM-SS Cas9 infectadas con VIH-1 IN+ a 1 ppp, que se estableció en 1. Media ± desviación estándar de 3 réplicas biológicas.

Datos fuente

Para confirmar la importancia de estas cinco proteínas, así como de los otros cuatro componentes del complejo SMC5/6 conocidos (NSMCE1, 2 y 4, y SLF2), inhibimos su expresión en células CEM-SS Cas9 utilizando dos sgRNA independientes (Extended Data Fig. . 1). La eliminación de cualquiera de los ocho componentes SMC5/6 mejoró sustancialmente la expresión de GFP del vector IN-NL-GFPΔEnv. Como la eliminación de SWI5 no tuvo ningún efecto, se consideró que este gen era un falso positivo.

A continuación, generamos líneas celulares knockout clonales en células CEM-SS, para SMC5, SMC6, NSMCE2, NSMCE4, SLF1 y SLF2. En cada caso, excepto NSMCE2, generamos dos líneas celulares knockout independientes para evitar una posible variación clonal. Estos genes eliminados se verificaron mediante la identificación de mutaciones de cambio de marco inactivantes mediante secuenciación de ADN (Tabla complementaria 1) y mediante transferencia Western (Datos extendidos Fig. 2). Las células mutantes mostraron la misma cinética de crecimiento que las células CEM-SS de tipo salvaje (WT) (Datos ampliados, Fig. 3). La infección de estas líneas celulares con el reportero IN− NL-NLucΔEnv, en el que GFP se reemplazó con nano luciferasa (NLuc)10, reveló un rescate parcial de la expresión de NLuc del ADN del VIH-1 no integrado (Datos extendidos Fig. 3d). Además, la infección de estos clones knockout con el virus IN− NL-GFPΔEnv a una multiplicidad de infección (MOI) de ~0,3 reveló un nivel similar de células GFP+ (del 29 % al 43 % positivo, Fig. 1b) al observado en WT Células CEM-SS infectadas con una forma IN+ de NL-GFPΔEnv (32% positivo, Fig. 1c), aunque el virus IN+ indujo una intensidad media de fluorescencia más alta. La infección de células ΔSMC5 CEM-SS con la forma IN+ de NL-GFPΔEnv produjo muchas más células GFP+ en comparación con las células WT CEM-SS (Fig. 1c frente a 1d). Como la integración proviral del VIH-1 es ineficiente17, planteamos la hipótesis de que este aumento se debe a la transcripción del ADN del VIH-1 IN+ no integrado. La infección de células WT CEM-SS con el virus IN-NL-GFPΔEnv no generó ninguna célula GFP+ (Fig. 1b).

Nos preguntamos si las células que carecen de la función del complejo SMC5/6 apoyarían la replicación de IN− HIV-1. Como se muestra en la Fig. 1e-h, IN− HIV-1 que lleva la mutación inactivante de la integrasa D64V de hecho estableció la propagación de infecciones en los subclones ΔSMC5 y ΔSLF2, logrando niveles sustanciales de ADN viral, ARN y expresión de proteínas 14 días después de la infección (dpi) cuando se cultiva en presencia de raltegravir para prevenir cualquier mutación revertida. No se observó replicación de IN-VIH-1 en células WT CEM-SS (Fig. 1f-h). La replicación IN-VIH-1 en células que carecen de complejos SMC5/6 funcionales causó citopaticidad viral que eliminó todo el cultivo a los 16 ppp (Fig. 1e). Es importante destacar que a los 14 ppp, la mutación inactivante D64V IN se mantuvo por completo. Además, mientras que se detectaron 2 círculos de repetición terminal larga (2LTR) característicos del ADN del VIH-1 no integrado en cultivos infectados por virus IN+ e IN−, el VIH-1 integrado se detectó mediante la cuantificación de integraciones en regiones Alu-repetidas en el genoma mediante Alu- La PCR cuantitativa basada (Alu-qPCR)18 solo estaba presente en el primero (datos extendidos, Fig. 3b,c). Por lo tanto, mientras que la replicación de IN- HIV-1 en células que carecen del complejo SMC5/6 es ciertamente más lenta que IN+ HIV-1 (Fig. 1f-h), es notable que IN- HIV-1 pueda replicarse en absoluto.

La represión epigenética del ADN del VIH-1 no integrado se correlaciona con la adición de la modificación histona represiva H3K9me3 y la pérdida de las modificaciones activadoras H3Ac y H3K4me34,10. Por lo tanto, probamos si la pérdida del complejo SMC5/6 evitaría el silenciamiento epigenético. El análisis de la adición de las modificaciones activadoras de H3Ac y H3K4me3 al ADN de IN− HIV-1 no integrado reveló un nivel similar al observado con IN+ HIV-1 en los subclones ΔSMC5 y ΔSLF2 (datos extendidos Fig. 4a,b). De manera similar, las células que carecían del complejo SMC5/6 mostraron modificaciones H3K9me3 inhibidoras perdidas en el ADN del VIH-1 no integrado (Datos ampliados, Fig. 4c). En contraste, ni el nivel de unión total de la histona H3 al ADN viral (datos extendidos Fig. 4d) ni el nivel de H3K27me3 (datos extendidos Fig. 4e) se vieron afectados de manera apreciable.

Aunque se ha informado que la proteína Vpr del VIH-1 mejora la expresión génica del ADN del VIH-1 no integrado9,19 y degrada el componente SLF29 de SMC5/6, hemos informado anteriormente que la sobreexpresión de Vpr no mejora la expresión génica de IN-VIH-110, y los virus WT Vpr+ son fuertemente inhibidos por los inhibidores de la integrasa3. Para probar el efecto de Vpr en la expresión de genes virales no integrados, infectamos células WT o ΔSMC5 CEM-SS con el virus IN− NL-GFPΔEnv ±Vpr y no vimos ninguna diferencia perceptible (Datos extendidos Fig. 5).

El complejo SMC5/6 SUMOila varios sustratos proteicos, incluido él mismo13, a través de la ligasa SUMO E3 NSMCE220,21. La actividad SUMOylation, que es estimulada por la unión al ADN22, es esencial para el papel del complejo SMC5/6 en la reparación y recombinación del ADN13. Varios componentes de la cromatina, incluida la histona H4, pueden SUMOilarse y la SUMOilación de histonas se asocia con la represión transcripcional23,24. Para determinar si la SUMOylación de la cromatina por SMC5/6 contribuye al silenciamiento epigenético del ADN del VIH-1 no integrado, eliminamos NSMCE2 en las células CEM-SS según lo confirmado por la secuenciación del ADN (Tabla complementaria 1) y transferencia Western (Datos extendidos Fig. 2) . La pérdida de NSMCE2 rescató la expresión de GFP del virus IN-NL-GFPΔEnv. Este rescate se bloqueó con la expresión ectópica de WT NSMCE2 pero no con el mutante NSMCE2ΔSUMO, que carece de actividad de SUMOilación debido a las mutaciones C185S/H187Q introducidas en el dominio del dedo RING25 esencial (Fig. 2a). Se observó un resultado similar con el virus informador IN− NL-NLucΔEnv en el sentido de que la pérdida de la expresión de NSMCE2 en el subclón ΔNSMCE2 rescató la expresión de NLuc del ADN del VIH-1 no integrado y este rescate fue bloqueado por la expresión de WT pero no del mutante NSMCE2 (Fig. 2b ). Esto no se debió a la inestabilidad del mutante NSMCE2ΔSUMO (Fig. 2c). Además, tanto las formas WT como ΔSUMO de NSMCE2 se unieron al ADN del VIH-1 no integrado y la pérdida de expresión de NSMCE2 no inhibió el reclutamiento del componente SMC5 del complejo SMC5/6 en el ADN viral (Fig. 2d). La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)-qPCR usando un anticuerpo específico para SUMO2/3 en células WT CEM-SS, ΔNSMCE2 y ΔSMC5 infectadas con IN− NL-GFP detectó fácilmente la modificación de SUMO en ADN de VIH-1 cromatinizado no integrado en células WT pero no en células que carecen de NSMCE2 o SMC5, que mostraron niveles de fondo de unión de anticuerpos (Fig. 2d, e).

a, Citometría de flujo a 2 ppp de células T WT o ∆NSMCE CEM-SS transducidas con un vector lentiviral que no expresa nada, FLAG-NSMCE2 o el mutante FLAG-NSMCE2∆SUMO y luego infectadas con IN− NL-GFPΔEnv a una MOI de ~ 0.3. Se muestra un experimento representativo de 3 réplicas biológicas. b, Cuantificación de la expresión de NLuc codificada viralmente en las células indicadas infectadas con IN+ o IN− NL-NLucΔEnv. La expresión de NLuc se normalizó a la infección IN-VIH-1 de células WT CEM-SS, que se estableció en 1 (** P = 0,0010, *** P = 0,0009, **** P < 0,0001, análisis de 1 vía de varianza (ANOVA), prueba de Dunnett). c, Western blot representativo de WT FLAG-NSMCE marcado con FLAG y la expresión de NSMCE2∆SUMO después de la transducción de los tipos de células indicados. d, cuantificación de ChIP-qPCR del nivel de NSMCE2 etiquetado con FLAG expresado ectópicamente unido o SMC5 endógeno al ADN IN− HIV-1 no integrado en células T WT o ∆NSMCE CEM-SS. La deposición de SUMO2/3 también se determinó mediante ChIP-qPCR (ΔNSMCE2 + NSMCE2 ***P = 0,0002, ΔNSMCE2 + NSMCE2ΔSUMO ***P = 0,0003; ANOVA de 2 vías, prueba de Dunnett). e, Cuantificación del nivel de depósito de SUMO2/3 en la LTR de VIH-1 a 2 ppp en células WT y ∆SMC5 CEM-SS infectadas con IN− NL-GFPΔEnv. IgG sirvió como control negativo (****P < 0,0001, ANOVA de 2 vías, prueba de Sidak). Los datos en b, d y e son la media ± sd de 3 réplicas biológicas.

Datos fuente

Si la SUMOilación de la cromatina es crucial para el silenciamiento epigenético del ADN del VIH-1 no integrado, entonces los fármacos que inhiben la SUMOilación deberían rescatar la expresión génica por IN-VIH-1. El fármaco contra el cáncer TAK-981 es un inhibidor específico de la enzima activadora de SUMO, que cataliza el primer paso en la SUMOilación de proteínas26. Realizamos un experimento de respuesta a la dosis TAK-981 en células WT CEM-SS, así como en el subclón ΔSMC5 después de la infección con el reportero IN-NL-NLucΔEnv. Se añadieron niveles de TAK-981, de 5 nM a 1000 nM, a 0 ppp, se lisaron las células y se cuantificaron los niveles de NLuc a 2 ppp. De hecho, TAK-981 impulsó la expresión de NLuc del ADN del VIH-1 no integrado, alcanzando una meseta a ~ 75 nM donde el nivel de expresión de NLuc del vector IN− NL-NLucΔEnv en células WT igualó el nivel inducido en células ΔSMC5 (Fig. 3a) . Por el contrario, TAK-981 no tuvo efecto sobre la expresión génica del reportero IN− NL-NLucΔEnv en células ΔSMC5 en todas las dosis probadas, lo que argumenta que el efecto positivo de TAK-981 sobre la expresión génica del ADN de VIH-1 no integrado en WT CEM- Las células SS se debieron por completo a la inhibición de la función SMC5/6.

a, Expresión viral de NLuc a 2 ppp en células WT y ∆SMC5 CEM-SS infectadas con IN− NL-NLucΔEnv y tratadas con las concentraciones indicadas de TAK-981 desde el día 0 (****P < 0,0001, *P = 0,015 ; ANOVA de 2 vías, prueba de Sidak). b, Niveles de ARN viral para ARN no empalmado (ARNm de Gag), empalmado individualmente (A1D1) y empalmado de forma múltiple (A4D7) en células CEM-SS infectadas con IN+ o IN− HIV-1 ±150 nM de TAK-981, medido a 2 ppp . Los niveles de ARN se normalizaron a las infecciones por VIH-1 WT sin TAK-981, que se estableció en 1, y las estadísticas se calcularon mediante una prueba t de Welch no apareada de 2 colas (Gag: *P = 0,037, ***P = 0,004; A1D1: *P = 0,033, **P = 0,0012, A4D7: **P = 0,0059, **P = 0,0078). c, Expresión viral de NLuc a 3 ppp en células WT y ∆SMC5 CEM-SS infectadas con IN-NL-NLucΔEnv, con TAK-981 150 nM añadido en el hpi indicado. La expresión de NLuc se proporciona en relación con las células WT CEM-SS no tratadas con TAK-981, que se estableció en 1. d–f, ChIP–qPCR para cuantificar las cantidades de SUMO2/3 (d), H3Ac (e) y H3K9me3 ( f) depositado en el HIV-1 LTR a 3 dpi. Se añadió TAK-981 (150 nM) en el hpi indicado. Los datos de d–f se analizaron mediante ANOVA de 2 vías, prueba de Tukey (****P < 0,0001, **P = 0,0012). Los datos en a–f son la media ± sd de 3 réplicas biológicas.

Datos fuente

Para abordar el efecto de TAK-981 en la expresión del ARNm del VIH-1, utilizamos qPCR para cuantificar el nivel de transcritos de VIH-1 no empalmados, empalmados por separado y empalmados por completo en células T WT CEM-SS infectadas con WT o IN− HIV-1 en presencia o ausencia de TAK-981 150 nM (Fig. 3b). TAK-981 aumentó modesta pero significativamente la expresión de especies de ARN viral por IN+ HIV-1 y aumentó fuertemente la expresión de las tres clases de ARN viral de IN− HIV-1.

Para determinar si el momento de la adición de TAK-981 afectaría de manera diferente la expresión del gen viral del ADN del VIH-1 no integrado, infectamos células WT o ΔSMC5 CEM-SS con IN− NL-NLuc ΔEnv y luego añadimos TAK-981 en diferentes momentos. de 0 a 48 hpi (Fig. 3c). A las 72 hpi, las células se lisaron y se determinó la actividad de NLuc. La adición de TAK-981 a las 0 hpi rescató la expresión de NLuc del virus informador IN-NL-NLucΔEnv al nivel observado en el subclón ΔSMC5 y esto permaneció así hasta las 24 hpi. Sin embargo, el rescate de la expresión de NLuc por TAK-981 fue más débil a las 36 hpi e indetectable a las 48 hpi. Para determinar si la adición de TAK-981 efectivamente inhibía la SUMOilación del ADN del VIH-1 cromatinizado no integrado, realizamos ChIP-PCR para determinar el nivel de SUMO presente en el LTR viral en células WT CEM-SS, en presencia y ausencia de 150 nM TAK-981, y en el clon ΔSMC5, a 3 dpi con IN− NL-NLucΔEnv. La adición de TAK-981 dio como resultado la pérdida de SUMO del ADN de VIH-1 no integrado, independientemente de si el fármaco se agregó temprano o tarde después de la infección (Fig. 3d). Por lo tanto, aunque TAK-981 es ineficaz para rescatar la expresión génica del ADN del VIH-1 no integrado si se agrega a las 36 hpi o más tarde (Fig. 3c), sigue siendo eficaz para prevenir el mantenimiento de la modificación SUMO dinámica en el ADN viral (Fig. 3d). Estos datos sugieren que SUMOylation por SMC5/6 desencadena el silenciamiento epigenético del ADN del VIH-1 no integrado, pero no es necesario para mantener el estado silenciado. Esta hipótesis fue respaldada aún más por el análisis ChIP-qPCR de las modificaciones epigenéticas presentes en el ADN viral no integrado en presencia y ausencia de TAK-981 (Fig. 3e, f). La adición de TAK-981 150 nM a las 16 hpi o 24 hpi rescató la adición de la modificación epigenética activadora H3Ac al ADN de VIH-1 cromatinizado no integrado y bloqueó la adición del marcador represor H3K9me3. Por el contrario, a las 36 hpi, TAK-981 fue ineficaz para revertir el silenciamiento epigenético del ADN del VIH-1 no integrado. Por lo tanto, TAK-981 puede prevenir la represión epigenética de IN− HIV-1 si se aplica poco después de la infección, pero no puede rescatar provirus IN− HIV-1 silenciados epigenéticamente y preexistentes y, por lo tanto, no funciona como un agente reversor de latencia (LRA ).

Recientemente se propuso que la infección con IN+ HIV-1 podría generar provirus que habían sido silenciados epigenéticamente antes de la integración y luego permanecían silenciados después de la integración, generando así células T infectadas de forma latente27. Si es correcto, la inhibición del silenciamiento del ADN del VIH-1 no integrado por parte de SMC5/6 también debería inhibir la formación de células T con infección latente. Para probar esta hipótesis, preguntamos si la pérdida de expresión de SMC5/6 o el tratamiento con TAK-981 a 0 dpi inhibiría el establecimiento de infecciones latentes por VIH-1 en las células T CEM-SS. El ensayo utilizado28 implica la infección de células WT o ΔSMC5 CEM-SS con el virus indicador IN+ NL-GFPΔEnv en presencia o ausencia de TAK-981 a una MOI de ~0,1. A los 3 ppp, las células se sometieron a FACS y se aislaron células negativas para GFP que representaban células no infectadas o infectadas con VIH-1 latente. Los perfiles de FACS nuevamente mostraron un nivel más alto de células GFP+ en el WT CEM-SS tratado con TAK-981 a 0 dpi y en el ΔSMC5 CEM-SS independientemente del tratamiento con TAK-981 (Datos extendidos Fig. 6a), presumiblemente nuevamente como resultado de transcripción de provirus IN+ HIV-1 no integrados. Las células negativas para GFP aisladas se cultivaron durante 6 días adicionales y luego se trataron con diluyente dimetilsulfóxido (DMSO) o con TAK-981, acetato de miristato de forbol (PMA) o factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α). Tanto PMA como TNF-α son potentes activadores de la actividad de NF-kB y LRA efectivos28,29. Un día después, a 10 dpi, las células fueron nuevamente analizadas por FACS (en la Fig. 4a se muestra un experimento representativo y en la Fig. 4b se muestra una compilación de tres réplicas biológicas independientes). Es importante destacar que todo el ADN del VIH-1 no integrado se perdió de las células CEM-SS infectadas a los 7 ppp (datos extendidos, figura 6b), por lo que cualquier expresión de GFP observada a los 10 ppp debe originarse a partir de provirus integrados.

Las células WT o ΔSMC5 CEM-SS se infectaron con IN+ NL-GFPΔEnv ±TAK-981. A los 3 ppp, las células GFP- se aislaron mediante FACS (consulte Datos extendidos, Fig. 6a para conocer los perfiles de FACS relevantes) y luego las células se cultivaron durante 6 días adicionales para permitir que se perdiera todo el ADN del VIH-1 no integrado (Datos extendidos, Fig. 6b) antes de ser tratados con diluyente dimetil sulfóxido (DMSO), TAK-981 o los LRA PMA o TNF-α. Un día después, a 10 dpi, FACS analizó la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP). a, perfiles FACS representativos. b, Un resumen de datos en a que muestra la media ± sd de 3 réplicas biológicas (****P < 0.0001, ANOVA de 2 vías, prueba de Tukey). c, el ADN total del VIH-1 se cuantificó en las células indicadas a los 9 ppp antes de la adición del fármaco. Los datos son la media ± desviación estándar de 3 réplicas biológicas (****P < 0,0001, ANOVA de 1 vía, prueba de Dunnett).

Datos fuente

En células WT CEM-SS, PMA y TNF-α indujeron la expresión de GFP en ~5 % de las células negativas para GFP clasificadas, mientras que el nivel de células GFP+ en el cultivo no inducido fue de ~0,3 % (Fig. 4a,b), diferencia que es altamente significativa (P < 0.001). Por el contrario, el tratamiento con PMA o TNF-α a 9 dpi no logró inducir la expresión de GFP por encima del fondo en células WT CEM-SS tratadas a 0 dpi con TAK-981, o en el clon ΔSMC5 CEM-SS en ausencia o presencia de TAK -981 a 0 dpi (Fig. 4a, b), aunque la infección inicial de estas células, medida por la expresión de GFP, fue en realidad más alta que la observada en las células WT CEM-SS (Datos extendidos Fig. 6a).

Si la pérdida de la función del complejo SMC5/6 de hecho inhibe el establecimiento de infecciones latentes por VIH-1, entonces las células WT GFP− clasificadas por FACS (datos ampliados, Fig. 6) deberían contener más ADN proviral de VIH-1 latente que las células GFP− que carecía de la función SMC5/6 en el momento de la infección. De hecho, el análisis de qPCR realizado a 9 ppp antes de la adición del fármaco demostró que las células WT GFP− aisladas contenían significativamente (P < 0,001) más ADN del VIH-1 que las células GFP− ΔSMC5 o las células WT tratadas con TAK-981 en ese momento. de infección (Fig. 4c).

Si el silenciamiento epigenético del ADN del VIH-1 no integrado puede conducir al establecimiento de infecciones latentes, retrasar la integración podría aumentar el número de infecciones latentes. Para probar esta idea, infectamos células WT CEM-SS con la forma IN+ del virus indicador NL-GFPΔEnv en presencia o ausencia del inhibidor de la integrasa raltegravir. El fármaco se eliminó por lavado a 2 ppp y las células GFP− se aislaron mediante FACS a 5 ppp. A continuación, las células se trataron con diluyente, PMA o TNF-α a 11 ppp y se analizaron mediante FACS a 12 ppp. El tratamiento con raltegravir de 0 a 2 dpi de hecho aumentó el porcentaje de células que expresaban GFP después del tratamiento con PMA o TNF-α, aunque el número de GFP+, es decir, infecciones productivas detectadas a los 5 dpi, fue similar (Datos extendidos Fig. 7). Por lo tanto, prolongar significativamente el tiempo entre la síntesis del ADN proviral y la integración (P < 0,001) aumenta el número de provirus integrados latentes que luego pueden ser activados por un LRA. Estos datos demuestran que la latencia del VIH-1 puede establecerse antes de la integración proviral.

Para examinar si SMC5/6 también contribuye al establecimiento de la latencia viral en las células primarias, primero confirmamos que TAK-981 también podría rescatar la expresión génica del ADN del VIH-1 no integrado en las células T CD4+ primarias infectadas (Fig. 5a). A continuación, preguntamos si TAK-981 podría inhibir el establecimiento de infecciones latentes por VIH-1 en células T CD4+ primarias mediante un ensayo de latencia de VIH-1 que utiliza un virus informador de dos colores30,31. En estos virus, GFP se expresa bajo el control de HIV-1 LTR, que se silencia en infecciones latentes, mientras que mCherry se expresa utilizando el promotor exógeno EF1-α, que es resistente al silenciamiento epigenético. La infección de células T con un reportero de VIH-1 de dos colores genera células que son GFP+ y mCherry+, que representan infecciones productivas, y células que son GFP− pero mCherry+, que representan infecciones latentes. Por lo tanto, preguntamos si la adición de TAK-981 a 0 dpi pero no a 6 dpi a las células infectadas con el virus informador de doble color IN+ afectaría el nivel de células GFP− mCherry+ a 7 dpi, que es el punto de tiempo más temprano cuando todo no integrado El ADN del VIH-1 se habría perdido (Datos ampliados Fig. 8a).

a, las células T CD4+ aisladas de la sangre se infectaron con IN+ o IN- NL-NLucΔEnv en presencia de TAK-981 150 nM en DMSO o solo con DMSO, a 0 hpi. Las células se recogieron a las 48 hpi, se lisaron y se determinaron los niveles de NLuc. Media ± sd de 3 réplicas biológicas (** P = 0,0045, prueba t no apareada de 2 colas). b, los linfocitos T CD4+ se infectaron con un virus informador de doble color GFP/mCherry defectuoso en la replicación a una MOI baja de ~0,05 en presencia de DMSO o TAK-981 150 nM añadido en la infección, o con TAK-981 150 nM o PMA 80 nM añadido a 6 ppp. A continuación, se determinó el número de células que expresan GFP y mCherry a 7 ppp mediante FACS. c–e, datos de 5 infecciones primarias independientes de células T CD4+ realizadas como en b que muestran el porcentaje de células GFP+ mCherry+ (c), GFP− mCherry+ (d) o GFP− mCherry− (e) a 7 ppp en presencia y ausencia de TAK-981 añadido a 0 ppp. Los experimentos individuales que utilizan las mismas muestras de células T ±TAK-981 están vinculados por líneas. f, Análisis estadístico de las proporciones a partir de los datos que se muestran en c–e utilizando una prueba t pareada de proporciones de 2 colas.

Datos fuente

De hecho, observamos una reducción constante en el número de células T primarias GFP− mCherry+ infectadas de forma latente cuando se añadió TAK-981 a 0 ppp (del 2,11 % al 0,79 % en la Fig. 5b), pero no vimos ningún efecto significativo en el nivel de células GFP− mCherry+ cuando se agregó TAK-981 a 6 ppp, como se predijo (Fig. 5b, consulte también Datos extendidos, Fig. 8b). Vimos un aumento concomitante en el porcentaje de células T GFP+ mCherry+ en el cultivo tratado con TAK-981 a 0 ppp (del 2,62 % al 4,43 %, en la Fig. 5b), lo que representa infecciones productivas. Una vez más, la adición de TAK-981 a 6 ppp no ​​tuvo efecto (Fig. 5b, consulte también la Fig. 8b de datos ampliados).

Como se muestra en la Fig. 5c-e, que presenta datos compilados de cinco réplicas biológicas independientes que utilizan células T CD4+ primarias de cinco donantes de sangre diferentes, observamos un aumento constante en la cantidad de células T GFP+ mCherry+ (Fig. 5c) y una disminución en el número de células GFP− mCherry+ (Fig. 5d) en cada experimento analizado. En general, la adición de TAK-981 a 0 ppp aumentó el número de células GFP+ mCherry+ productivamente infectadas en 1,62 ± 0,024 veces (P < 0,0001) y disminuyó el número de células GFP− mCherry+ infectadas de forma latente en 0,55 ± 0,115 veces (P = 0,007) (Fig. 5f). El aumento en las células GFP+ mCherry+ se derivó no solo de la población GFP− mCherry+ sino también de la población GFP− mCherry−, que disminuyó de manera modesta pero significativa en el cultivo tratado con TAK-981 a 0 dpi (Fig. 5e, f, relación general 0,98 ± 0,006, P = 0,047). Por lo tanto, el tratamiento con TAK-981 a 0 dpi también inhibe la generación de células en las que tanto el promotor LTR como el EF1-α están silenciados epigenéticamente.

Aquí mostramos que el complejo SMC5/6 humano induce la SUMOilación del ADN del VIH-1 no integrado cromatinizado que conduce a su silenciamiento epigenético. Como resultado, la pérdida de la expresión de SMC5/6, o la inhibición de la SUMOilación de la cromatina usando el inhibidor TAK-981, rescata la expresión génica del ADN del VIH-1 no integrado e incluso permite que IN-VIH-1 establezca una infección que se propaga en células T cultivadas ( Figura 1). Sorprendentemente, también demostramos que la pérdida de la expresión de SMC5/6, o el tratamiento con TAK-981, inhibe notablemente el establecimiento de la latencia del VIH-1 tanto en la línea de células T CEM-SS como en las células T CD4+ primarias (Figs. 4 y 5). ).

Aunque las terapias antirretrovirales pueden reducir la carga viral en pacientes con SIDA por debajo del nivel de detección, estos medicamentos no logran curar el VIH-1. Esto se debe a la presencia continua de un pequeño número de células T infectadas de forma latente que contienen provirus del VIH-1 intactos integrados que son transcripcionalmente inertes pero que pueden activarse mediante estímulos externos para reavivar la replicación viral32. Si bien se ha realizado un esfuerzo considerable para tratar de desarrollar LRA que puedan activar el VIH-1 latente y, en presencia de terapias antirretrovirales, limpiar el cuerpo de virus infecciosos, hasta ahora este esfuerzo no ha logrado identificar LRA que sean efectivos y no. -tóxico.

El reservorio latente se ha atribuido a las células T activadas que están infectadas por el VIH-1 coincidiendo con su reversión a células T de memoria en reposo32. Sin embargo, la latencia del VIH-1 se puede establecer tanto en las líneas de células T CD4 como en las células T activadas in vitro28,31, y la mayor parte del reservorio latente en pacientes que reciben terapias antirretrovirales se mantiene a través de la expansión clonal33,34,35,36, con muchas células latentes. células que expresan los marcadores de proliferación HLA-DR37,38, CD2539 y CD6940. Por lo tanto, la represión de la expresión del gen del VIH-1 en estado de latencia no es simplemente el resultado del estado de reposo de las células T de memoria en reposo. También se ha propuesto que la latencia resulta de la integración de los provirus del VIH-1 en regiones de heterocromatina, lo que da como resultado un silenciamiento epigenético41. Sin embargo, el análisis de sitios de integración de VIH-1 latentes individuales en pacientes ha demostrado que la mayoría de los provirus de VIH-1 de longitud completa intactos se integran en genes transcritos activamente42,43,44,45,46. En general, los mecanismos subyacentes al establecimiento de la latencia del VIH-1 han permanecido esquivos y los factores celulares que promueven la latencia viral en gran parte no están definidos.

Nuestros datos sugieren que el mecanismo clave subyacente al inicio de la latencia del VIH-1 es el silenciamiento epigenético por SMC5/6 de provirus no integrados que retienen sus modificaciones epigenéticas inhibidoras preexistentes después de la integración. Estos datos identifican al complejo SMC5/6 como directamente involucrado en promover el establecimiento de la latencia del VIH-1 y sugieren que la latencia no resulta de ninguna propiedad intrínseca del retrovirus entrante, sino más bien de un desafortunado efecto secundario de una respuesta inmunitaria celular innata que probablemente evolucionado para silenciar el ADN extraño invasivo.

Las células 293T humanas (hembra) se adquirieron inicialmente de la American Type Culture Collection (ATCC) y se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma) suplementado con suero fetal bovino al 10 % (FBS, Hyclone) y un antibiótico-antimicótico (Gibco ).

Células CEM-SS humanas (hembra) se obtuvieron del NIH AIDS Reagent y se cultivaron en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado con FBS al 10 % y antibiótico-antimicótico.

Se produjeron células CEM-SS que expresaban establemente la proteína Cas9 utilizando un plásmido pLentiCrispr v2-Blast modificado que fue un regalo de Mohan Babu (plásmido Addgene 83480). El promotor U6, el armazón de ARNsg y el promotor EF1-α se escindieron de pLentiCrispr v2-Blast mediante escisión con KpnI y AgeI y se reemplazaron con un promotor SFFV. Los lentivirus se fabricaron a partir de esta construcción mediante la transfección de 5 × 106 células 293T en una placa de 15 cm con 15 µg del vector lentiviral, así como 10 µg y 5 µg de los plásmidos de empaquetamiento pCMVR8.74 y pMD2.G, respectivamente, utilizando polietilenimina. (PEI). Los medios se cambiaron 24 h después de la transfección (hpt). Los sobrenadantes que contenían partículas lentivirales se recogieron a 72 hpt, se filtraron a través de un filtro de 0,44 µm y se pasaron por un concentrador de 100.000 MWCO (Amicon). Después de la concentración, se incubaron 5 × 106 células CEM-SS con 2 ml del sobrenadante concentrado a 37 °C durante la noche. Luego, los medios se reemplazaron con medio RPMI fresco y las células se incubaron durante 48 h. En este punto, los medios se reemplazaron con medio RPMI fresco complementado con 20 µg ml−1 de blasticidina (Santa Cruz) para permitir la selección de células transducidas. A continuación, las células se clonaron de una sola célula mediante alícuotas de dilución limitada en placas de 96 pocillos de modo que cada pocillo tuviera una probabilidad de ~10 % de tener una célula en él. A continuación, estas células clonadas se analizaron en cuanto a actividad Cas9.

La sangre humana de donantes sanos se compró en el Centro Regional de Sangre de la Costa del Golfo. Todos los donantes dieron negativo para VIH-1 y VIH-2. Las muestras se anonimizaron antes de comprarlas. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre total mediante centrifugación en gradiente de densidad sobre Histopaque (Sigma) y se aislaron células CD4+ usando un kit de aislamiento de CD4+ (Invitrogen). Las células CD4+ aisladas se activaron mediante incubación con anticuerpos contra CD28/CD49d (BD Biosciences) y 5 µg ml−1 de fitohemaglutinina (PHA) en RPMI suplementado con FBS al 10 % e IL-2 como se describió anteriormente47. Las células se mantuvieron en 105-106 células por ml en presencia de IL-2, anticuerpos CD28/CD49d y PHA durante 1 semana antes de la infección por VIH-1.

Se generó un virus informador de nano luciferasa de VIH-1 (NL-NLuc) a partir del virus parental NL4-3 mediante la sustitución del gen viral nef en NL4-3 con el gen indicador NLuc48. NL-NLucΔEnv se hizo a partir de NL-NLuc mediante la eliminación de un segmento de 943 pb del gen env que hace que la replicación sea incompetente. De manera similar, el virus informador GFP (NL-GFPΔEnv) se generó a partir de NL-NLucΔEnv sustituyendo GFP en lugar de nef. El virus informador NL-DC expresa eGFP bajo el control de HIV-1 LTR y mCherry a partir de un promotor EF1-α interno y se generó mediante la clonación de un casete EF1-α:mCherry en el sitio XhoI ubicado 3 'a GFP en NL- GFPΔEnv. Todos estos virus indicadores tienen un gen vpr intacto.

Se creó un virus informador GFP, IN-NL-GFPΔVpr, que carece de una proteína Vpr funcional, a partir del virus parental IN-NL-GFP mediante la inserción de una duplicación TTAA en 15 pb 3 'del codón de parada Vif. Esto introduce un codón de terminación y una mutación de cambio de marco temprano en el marco de lectura abierto de Vpr que crea una proteína Vpr truncada no funcional49. Estos virus tienen integrasa WT (IN+) o contienen la mutación D64V (IN-) que bloquea la función IN.

Los plásmidos que expresan el provirus NL-NLuc competente para la replicación se transfectaron en células 293T usando PEI. Los provirus NL-NLucΔEnv y NL-GFPΔEnv que no se propagan se cotransfectaron en células 293T con el plásmido pMD2.G que codifica la proteína VSV-G. Después de 24 h, los medios gastados se reemplazaron con medios nuevos. A las 72 hpt, los medios sobrenadantes se filtraron a través de un filtro de 0,44 μm. Los medios sobrenadantes que contenían VIH-1 WT o IN- se normalizaron mediante los niveles de p24, medidos por ELISA, antes de usarse para infectar las células diana. La relación de volumen normalizado MOI:p24 se evaluó infectando 106 células CEM-SS con IN+ NL-GFPΔEnv, o una línea celular Tax inducible por CEM-SS (que expresa una proteína Tax HTLV-1 que se sabe que activa la expresión génica del VIH no integrado). -110) con IN− NL-GFPΔEnv. Estas células se infectaron con diluciones variables del virus, luego se analizaron mediante citometría de flujo a 2 ppp (estrategia de selección descrita en Datos extendidos Fig. 9). El número de células GFP+ en cada dilución se convirtió luego en MOI utilizando la fórmula MOI = −ln (1− proporción de células GFP+) que luego se correlacionó con el nivel de p24 en el stock viral. Por lo tanto, se pudo determinar la cantidad de virus IN- utilizada (por millón de células) para cada MOI.

La biblioteca de inactivación CRISPR humana de Brunello (Addgene 73178)15 se utilizó para transformar células electrocompetentes (Endura). De la biblioteca (resuspendida en agua), se usaron 500 ng para transformar un total de 4 × 25 μl de células en una cubeta de 1 mm (10 μF, 600 Ω, 1,8 kV) para producir >108 colonias cuando se colocaron en placas para garantizar que cada sgRNA en la biblioteca se cubrió ~1,000× en promedio. Estas colonias se recogieron y los plásmidos de la biblioteca agrupados se extrajeron usando columnas Maxiprep (Zymo).

Las bibliotecas lentivirales se crearon transfectando células 293T con ADN de biblioteca y los plásmidos de empaquetamiento pCMVR8.74 y pMD2.G usando PEI. Los medios se cambiaron a las 24 hpt y el sobrenadante que contenía la biblioteca de lentivirus se recogió y filtró a través de un filtro de 0,44 µm a las 72 hpt. El lentivirus se tituló y se usó para transducir células CEM-SS Cas9 que luego se sometieron a curvas de eliminación de puromicina (Gemini) a los 2 dpt para determinar la cantidad de lentivirus que se correlacionaba con una MOI de 0,3. Luego, esta cantidad se usó para transducir 108 células CEM-SS Cas9 a 0, 3 MOI, y las células se seleccionaron en 1 µg ml-1 de puromicina a 2 dpt durante una semana.

Las células knockout agrupadas luego se infectaron durante 2 días con un virus informador IN-HIV-1 NL-GFP que tiene una sustitución de aminoácido D64V inactivante en el gen de la integrasa. A continuación, estas células infectadas se pasaron por un FACS Aria II (BD Biosciences) que contenía BSL-3 para recoger la población de células GFP+ de la que se extrajo el ADN genómico. El ADNg purificado se incubó con la enzima de restricción DpnI para eliminar cualquier contaminación plásmida residual.

El sgRNA de este ADN se amplificó mediante PCR usando cebadores flanqueantes (FP: 5′-TGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGA -3′ RP: 5′-GGCTCGAGGGGGCCCGGGTGCAAAGATGGATA -3′) y luego se clonó de nuevo en el plásmido pLentiGuide Puro parental a través de los sitios de restricción NdeI y XmaI. Se llevaron a cabo rondas posteriores de transformación, producción de lentivirus, transducción e infección como se describe para un total de 3 rondas. En la ronda final, el ADN se amplificó utilizando los cebadores de secuenciación indexados de Illumina, se purificó en una columna giratoria de purificación de PCR (Zymo) y se secuenció en NovaSeq 6000.

Los datos de secuenciación se analizaron con MAGECK-VISPR50 generando primero recuentos de lectura de sgRNA invocando el 'recuento de mageck', analizando el enriquecimiento de sgRNA y obteniendo rangos de genes utilizando el algoritmo Robust Rank Aggregation en recuentos de lectura normalizados. La 'prueba Mageck' se ejecutó con los parámetros '–remove-zero both–remove-zero-threshold 0' como se sugirió anteriormente51.

Se generaron células knockout de un solo gen mediante la transducción de células CEM-SS Cas9 con lentivirus elaborados a partir de un plásmido pLentiGuide-Puro (Addgene 52963)52 que expresa el sgRNA de interés. Las células transducidas se seleccionaron a los 2 dpt con 1 µg ml−1 de puromicina durante 1 semana. Los experimentos de infección en células knockout policlonales se llevaron a cabo infectando células en esta etapa.

Las células clonales se aislaron dividiendo en alícuotas las células resistentes a la puromicina en una dilución límite en una placa de 96 pocillos, aislamiento y expansión posteriores. A continuación, las células knockout se identificaron y validaron mediante secuenciación clonal de las lesiones genéticas y mediante transferencia Western.

Las células se recogieron y lisaron en tampón Laemmli, se sometieron a ultrasonidos y se desnaturalizaron a 95 °C durante 15 min. Los lisados ​​se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS al 4-20 % (Bio-Rad), se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y luego se bloquearon en leche al 5 % en PBS + Tween al 0,1 %. Las membranas se incubaron en anticuerpos primarios y secundarios diluidos en leche al 5 % en PBS + Tween al 0,1 % durante 2 h cada uno y luego se lavaron en PBS + Tween al 0,1 %. Las membranas se incubaron con un sustrato quimioluminiscente mejorado basado en luminol y las señales se visualizaron utilizando GeneSnap (Syngene). Las membranas se inmunotransfirieron con anticuerpos específicos para detectar SMC5 (Research Resource Identifier RRID:AB_2900565), SMC6 (RRID:AB_2747157), NSMCE2 (RRID:AB_10637854), NSMCE4A (RRID:AB_11169701), SLF1 (RRID:AB_10816722), SLF2 ( RRID:AB_11129755), BANDERA (RRID:AB_259529) o actina (RRID:AB_2687938). Los anticuerpos primarios se usaron a una dilución de 1:1000, excepto el anticuerpo de actina que se usó a una dilución de 1:5000. Se utilizaron anticuerpos secundarios anti-ratón (RRID:AB258431) o anti-conejo (RRID:AB_258284) conjugados con HRP a una dilución de 1:5.000.

Las células se recogieron, se lavaron en PBS y se fijaron en paraformaldehído al 1 % en PBS durante 10 min antes de resuspenderse en albúmina de suero bovino (BSA) al 2 % en PBS y pasar por un filtro celular. Las células se pasaron por un citómetro de flujo Fortessa X20 (BD Biosciences) y los datos se analizaron con FlowJo v10.6.2.

Las células se recogieron, se lavaron tres veces en PBS, se lisaron en tampón de lisis pasiva (Promega) y se analizó la actividad de NLuc usando el ensayo de luciferasa Nano-Glo en un luminómetro Lumat LB9507 (Bertold Technologies).

Las células (107) de la línea celular parental Cas9, o las líneas celulares ΔSMC5 y ΔSLF2, se infectaron con virus WT o IN-NL-NLuc en un total de 20 ml de RPMI. Las reservas virales se pretrataron con 5 U ml-1 de ADNasa I para eliminar el ADN plásmido residual, y todas las infecciones IN- se llevaron a cabo en presencia de raltegravir 20 µM para evitar mutaciones revertidas. Las células se contaron los días 1, 2, 3, 5, 7, 10, 12, 14 y 16 dpi cuando fue posible, y los medios se renovaron periódicamente para mantener los recuentos celulares por debajo de 106 células por ml. Se recogieron células vivas (106) en cada punto de tiempo (cuando fue posible) y se dividieron por igual para analizar NLuc y para la extracción de ADN y ARN.

Para el análisis de ADN, las células se sedimentaron y se lavaron tres veces en PBS enfriado con hielo. Luego se extrajo el ADN utilizando columnas DNA Miniprep Plus (Zymo) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, luego se incubó con DpnI (NEB) para eliminar cualquier contaminación plásmida residual.

Para el análisis de ARN, las células se lisaron en TRIzol (Thermo Fisher) para recoger el ARN y se trataron con ADNasa I para eliminar la contaminación de ADN residual. A continuación, el ARN se convirtió en ADN complementario utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems).

La cuantificación del ADN y el ARN del VIH-1 total se llevó a cabo en una máquina de qPCR en tiempo real QuantStudio 6 Pro (Thermo Fisher) utilizando una sonda TaqMan de VIH-1 total personalizada que amplifica la región U5-gag en el VIH-1.

Para la qPCR anidada en tiempo real Alu-LTR, el ADN se amplificó utilizando un enfoque de PCR anidada18. Brevemente, se realizó una PCR inicial no saturada usando los cebadores ALU1 (5′-TCCCAGCTACTGGGGAGGCTGAGG-3′), ALU2 (5′-GCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACA-3′) y L-HIV (5′-ATGCCACGTAAGCGAAACTTAAGCCTCAATAAAGCTTGC-3′) usando ADN aislado de Células infectadas con VIH-1. Después de purificar los productos de la PCR con un kit PCR Kleen (Bio-Rad), se realizó qPCR anidada con los cebadores AA55M (5′-GCTAGAGATTTTCCACACTGACTAA-3′) y L (5′-ATGCCACGTAAGCGAAAC-3′) y la mezcla maestra verde SYBR (Termo Pescador).

Las cantidades de ADN circular 2LTR HIV-1 no integrado se cuantificaron mediante qPCR usando cebadores/sondas TaqMan que amplifican a través de la unión U5-U3 solo presente en los círculos 2LTR (FP: 5′- AACTAGGGAACCCACTGCTTAAG -3′, RP: 5′- TCCACAGATCAAGGATATCTTGTC - 3′, sonda: 5′- FAM-ACACTACTTGAAGCACTCAAGGCAAGCTTT-TAMRA-3′)53.

A continuación, se llevó a cabo la cuantificación relativa utilizando el método ΔΔCT con β-actina como control interno utilizando una sonda de β-actina (ADN) genómica o de β-actina (ARN) empalmada. A continuación se realizó la cuantificación relativa mediante el método ΔΔCT54 con β-Actina como control interno.

Las células indicadas se cultivaron a 106 células por ml en RPMI y se infectaron con IN-NL-GFP. Las reservas virales se preincubaron con 5 U ml-1 de ADNasa I para eliminar la contaminación por plásmidos antes de la infección.

Las células se recogieron en los tiempos indicados después de la infección, se enjuagaron dos veces con PBS y se entrecruzaron con formaldehído al 1 % durante 15 min a 25 °C antes de apagarlas en glicina 0,125 M durante 5 min. Luego, las células enjuagadas se lisaron en tampón de lisis ChIP (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, dodecilsulfato de sodio al 1 %, EDTA 10 mM) y se sonicaron en hielo con un Fisher Sonic Dismembrator 60 (salida 4,5, pulso de 20 s repetido 6 veces en hielo con 40 s entre cada sonicación). El sobrenadante que contenía cromatina sonicada se aclaró previamente mediante la adición de perlas magnéticas de Proteína G (Thermo Fisher) que habían sido pretratadas con ADN de esperma de salmón desnaturalizado (Invitrogen). Se retiraron las perlas magnéticas y la cromatina sonicada se incubó durante la noche a 4 °C usando 2,5 µg del anticuerpo indicado en tampón de dilución ChIP (16,7 mM Tris-HCL pH 8,0, 1 % Triton X-100, 0,01 % SDS, 150 mM NaCl, EDTA 1,2 mM). La cromatina sonicada (5 %) se almacenó como ADN de entrada sin tratamiento adicional hasta el paso de reticulación inversa.

Luego se agregaron perlas de proteína G a la mezcla de cromatina y anticuerpo, se incubaron durante 2 horas a 4 °C y luego se lavaron 3 veces con tampón ChIP LiCl (10 mM Tris-HCL pH 8.0, 1% NP-40, 250 mM LiCl, 1 EDTA mM, desoxicolato de Na al 1 %) y dos veces con tampón TE (Tris-HCL 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM). Los complejos proteína-ADN se eluyeron de las perlas con un tampón de elución (NaHCO3 0,1 M, SDS al 1 %), se desentrecruzaron mediante incubación a 65 °C durante 16 h y a 95 °C durante 15 min, luego se digirieron mediante la adición de 50 μg proteinasa K e incubando a 50 °C durante 3 h. El ADN se extrajo usando un kit DNA Miniprep Plus (Zymo), se digirió con DpnI (NEB) para eliminar cualquier contaminación de plásmido y luego se usó para el análisis de qPCR usando cebadores que amplifican U5-R en el promotor del VIH-1 (FP: 5′- CTCTCTGGTTAGACCAGATC -3′, RP: 5′-GCTAGAGATTTTCCACACTG-3′). Los datos de ChIP se expresan como un porcentaje del ADN de entrada.

Se creó un vector lentiviral que expresa una proteína NSMCE2 etiquetada con FLAG que es resistente al corte por el sgRNA expresado en las células knockout CEM-SS ΔNSMCE2 mediante la mutación de la secuencia NSMCE2 de un plásmido de expresión (OHu31586, GenScript) a través de PCR de extensión superpuesta para introducir sinónimos Mutaciones de TC y CT en la secuencia objetivo de sgRNA (GTATCAACTCTGGTATGGAC a GcATtAACTCTGGTATGGAC). Este producto de PCR FLAG-NSMCE2 mutante se clonó luego en el vector lentiviral pLCE usando los sitios de restricción NheI y XhoI.

De manera similar, el mutante NSMCE2ΔSUMO se creó mediante PCR de extensión superpuesta para introducir las sustituciones de aminoácidos C185S y H187Q en el dominio RING necesario para la función de ligasa E3 SUMO25.

Los lentivirus se crearon a partir de pLCE (control), pLCE FLAG-NSMCE2 y pLCE FLAG-NSMCE2ΔSUMO, que luego se usaron para transducir células CEM-SS o CEM-SS ΔNSMCE2. Estas células se infectaron con IN+/IN- NL-NLuc o IN- NL-GFP a 0,3 MOI y las células se recolectaron a 2 dpi para los respectivos ensayos NLuc (NL-NLuc), o para citometría de flujo y ChIP-qPCR (NL -GFP). La expresión de estas construcciones de NSMCE2 se validó mediante transferencia Western.

TAK-981 (MedChemExpress) es un inhibidor global de SUMOylation26 y se reconstituyó en DMSO a un stock de 5 mM. Se añadió TAK-981 a células CEM-SS Cas9 y ΔSMC5 infectadas con NL-NLuc a concentraciones de 0, 5, 15, 30, 75, 150, 500 y 1000 nM, y las células se recogieron para un ensayo NLuc después de 2 ppp.

Para ensayar los efectos de TAK-981 sobre la expresión de ARN viral en células infectadas, se infectaron células CEM-SS con IN+/IN- NL-NLuc en presencia o ausencia de TAK-981 150 nM. El ARN se extrajo a 2 dpi con TRIzol (Thermo Fisher) y se trató con ADNasa I durante 2 h. A continuación, se elaboró ​​ADNc utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems). Los niveles de gag de ARN del VIH-1 sin empalmar o el ARN viral empalmado del aceptor 1 del donante 1 (A1D1) y el aceptor 4 del donante 7 de empalme (A4D7) se cuantificaron mediante qPCR usando los cebadores para gag (FP: 5′-GCGAGAGCGTCGGTATTAAGCG-3′ , RP: 5′-AATCGTTCTAGCTCCCTGCTTGC-3′), A1D1 (FP: 5′-GATCTCTCGACGCAGGACTC-3′, RP: 5′-TGGTCCTTTCCAAACTGGAT-3′) y A4D7 (FP: 5′- CAAGCTTCTCTATCAAAGCAACC -3′, RP: 5 '- AATCGAATGGATCTGTCTCTGTC -3′)55.

Para comprender la cinética de la inhibición de la SUMOilación en la expresión génica viral y las modificaciones epigenéticas en las células infectadas, se añadió TAK-981 150 nM a las células CEM-SS Cas9 y ΔSMC5 en el momento de la infección, o a los 16, 19, 21, 24, 36 y 48 cv. Las células se infectaron con NL-NLuc Δenv y se recolectaron a las 72 hpi para ensayos NLuc o ChIP-qPCR usando anticuerpos anti-SUMO2/3, H3Ac o H3K9me3 y cuantificando el promotor del VIH-1 usando cebadores que amplifican la región U5-R (FP : 5'- CTCTCTGGTTAGACCAGATC-3′, RP: 5'-GCTAGAGATTTTCCACACTG-3′). Los datos de ChIP se expresan como un porcentaje del ADN de entrada.

Se infectaron células CEM-SS WT o ΔSMC5 con el virus IN+ NL-GFPΔEnv a una MOI de ~0,1 en presencia o ausencia de TAK-981 150 nM. Se añadió nevirapina a las células a los 2 ppp para inhibir cualquier evento de infección tardía, y a los 3 ppp las células se lavaron y resuspendieron en BSA al 2 % en PBS para clasificarlas en un FACS Aria II (BD Biosciences) que contenía BSL-3 para aislar GFP. − células. Se permitió que estas células se recuperaran en medios de cultivo durante 6 días (9 ppp) antes del tratamiento con DMSO, TAK-981 150 nM, PMA 80 nM o 1 ng ml−1 TNF-α. Las células se recolectaron al día siguiente (10 dpi) para analizar la expresión de GFP por citometría de flujo.

Se infectaron células WT o ΔSMC5 CEM-SS con el virus IN+ NL-GFPΔEnv en presencia o ausencia de raltegravir 500 nM. A los 2 ppp, todas las células se lavaron tres veces con PBS, se volvieron a sembrar en RPMI con nevirapina y se cultivaron durante 3 días más. A los 5 ppp, las células GFP− se clasificaron, se dejaron recuperar en medios de cultivo durante 6 días, se trataron con DMSO, PMA o TNF-α (11 ppp) y se analizaron por citometría de flujo al día siguiente (12 ppp).

Tanto el control CEM-SS como las células ΔSMC5 se infectaron con una cantidad de p24 normalizada que se tituló previamente para dar un 10 % de células GFP+ en células CEM-SS +Ral (~0,45 MOI) y −Ral (0,1 MOI) a 5 ppp.

Los linfocitos T primarios activados aislados de PBMC se infectaron a una MOI baja de ~0,05 con un virus informador IN+ NL-DC que expresa eGFP del HIV-1 LTR y mCherry de un promotor interno EF1-α. Las infecciones se llevaron a cabo en presencia y ausencia de TAK-981 150 nM agregado en la infección, o con PMA 80 nM que se sabe que revierte el silenciamiento epigenético del VIH-1 en células latentes56 o TAK-981 150 nM agregado 24 h antes de la recolección. Las células se recogieron para citometría de flujo a 7 ppp en BSA al 2 % en PBS para medir la eGFP y la fluorescencia de mCherry. La población de linfocitos T CD4+ se separó de las células muertas y los desechos celulares seleccionando análisis de dispersión frontal y lateral. El alto enriquecimiento del kit CD4 Positive Isolation (Invitrogen) también nos permitió identificar la población de células T CD4+ enriquecidas y se realizó una selección para excluir los pocos monocitos CD4+ posibles que podrían estar presentes. Luego, los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando FlowJo v10.6.2.

También se extrajo ADN de estas células a 2, 3, 5 y 7 ppp, se incubó con DpnI para eliminar los contaminantes plásmidos de VIH-1 residuales y luego se cuantificaron las cantidades de ADN circular de VIH-1 2LTR no integrado mediante qPCR como se describe en una sección anterior.

El tamaño de la muestra y los valores de P se indican en el texto o en las leyendas de las figuras. Las barras de error en los experimentos representan desviaciones estándar de la media de experimentos independientes. Los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism o se informaron mediante las herramientas computacionales indicadas utilizadas en el análisis de la pantalla de eliminación de CRISPR. La información sobre los métodos estadísticos se especifica en las leyendas de las figuras.

Todos los materiales únicos generados en este estudio estarán disponibles previa solicitud razonable al contacto principal y también estarán disponibles a través del programa NIH AIDS Reagent.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido. Los datos de secuenciación generados en este estudio están disponibles en el Archivo de lectura de secuencias de NCBI con el identificador de conjunto de datos SRR18245559 (CRISPR Knockout Screen). Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Sakai, H. et al. La integración es esencial para la expresión génica eficaz del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1. J. Virol. 67, 1169-1174 (1993).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schwartzberg, P., Colicelli, J. & Goff, SP Construcción y análisis de mutaciones de deleción en el gen pol del virus de la leucemia murina de Moloney: una nueva función viral requerida para la infección productiva. Celda 37, 1043–1052 (1984).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Smith, SJ et al. Los inhibidores de transferencia de cadenas de integrasa son fármacos anti-VIH eficaces. Virus 13, 205 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Geis, FK & Goff, SP Los ADN de VIH-1 no integrados se cargan con histonas de enlace y núcleo y se silencian transcripcionalmente. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 116, 23735–23742 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, GZ, Wang, Y. & Goff, SP Las histonas se cargan rápidamente en ADN retroviral no integrado poco después de la entrada nuclear. Microbio huésped celular 20, 798–809 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Goff, SP Silenciamiento de ADN retrovirales no integrados. Virus 13, 2248 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tsai, K. & Cullen, BR Regulación epigenética y epitranscriptómica de la replicación viral. Nat. Rev. Microbiol. 18, 559–570 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhu, Y., Wang, GZ, Cingöz, O. & Goff, SP NP220 media en el silenciamiento del ADN retroviral no integrado. Naturaleza 564, 278–282 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dupont, L. et al. El complejo SMC5/6 compacta y silencia el ADN del VIH-1 no integrado y es antagonizado por Vpr. Cell Host Microbe 29, 792–805.e6 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Irwan, ID, Karnowski, HL, Bogerd, HP, Tsai, K. y Cullen, BR La reversión del silenciamiento epigenético permite una replicación robusta del VIH-1 en ausencia de la función de la integrasa. mBio 11, e01038-20 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Decorsière, A. et al. La proteína X del virus de la hepatitis B identifica el complejo Smc5/6 como un factor de restricción del huésped. Naturaleza 531, 386–389 (2016).

Artículo PubMed Google Académico

Murphy, CM et al. La proteína X del virus de la hepatitis B promueve la degradación de SMC5/6 para mejorar la replicación del VHB. Representante celular 16, 2846–2854 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aragón, L. El complejo Smc5/6: nuevas y viejas funciones del enigmático pariente de larga distancia. año Rev. Genet. 52, 89–107 (2018).

Artículo PubMed Google Académico

Wang, T., Wei, JJ, Sabatini, DM & Lander, ES Pantallas genéticas en células humanas utilizando el sistema CRISPR-Cas9. Ciencia 343, 80–84 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Doench, JG et al. Diseño de sgRNA optimizado para maximizar la actividad y minimizar los efectos fuera del objetivo de CRISPR-Cas9. Nat. Biotecnología. 34, 184–191 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Leavitt, AD, Robles, G., Alesandro, N. & Varmus, HE Los mutantes de la integrasa del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 retienen la actividad de la integrasa in vitro pero no logran integrar el ADN viral de manera eficiente durante la infección. J.Virol. 70, 721–728 (1996).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, CJ y Li, P. Cinética de la integración del ADN del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH) en células infectadas de forma aguda según lo determinado mediante un ensayo novedoso para la detección del ADN del VIH integrado. J.Virol. 75, 11253–11260 (2001).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brussel, A., Delelis, O. & Sonigo, P. Ensayo de PCR anidada en tiempo real Alu-LTR para cuantificar el ADN del VIH-1 integrado. Métodos Mol. Biol. 304, 139–154 (2005).

CAS PubMed Google Académico

Poon, B. & Chen, ISY La Vpr del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) aumenta la expresión del ADN del VIH-1 no integrado. J.Virol. 77, 3962–3972 (2003).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Andrews, EA et al. Nse2, un componente del complejo Smc5-6, es una ligasa SUMO necesaria para la respuesta al daño del ADN. mol. Celúla. Biol. 25, 185–196 (2005).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao, X. & Blobel, G. Una ligasa SUMO es parte de un complejo multiproteico nuclear que afecta la reparación del ADN y la organización cromosómica. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 102, 4777–4782 (2005).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Varejao, N. et al. El ADN activa la ligasa Nse2/Mms21 SUMO E3 en el complejo Smc5/6. EMBO J. 37, e98306 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Ryu, H.-Y. & Hochstrasser, M. Sumoilación de histonas y dinámica de la cromatina. Ácidos Nucleicos Res. 49, 6043–6052 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shiio, Y. & Eisenman, RN La sumoilación de histonas está asociada con la represión transcripcional. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 100, 13225–13230 (2003).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jácome, A. et al. NSMCE2 suprime el cáncer y el envejecimiento en ratones independientemente de su actividad ligasa SUMO. EMBO J. 34, 2604–2619 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Langston, SP y col. Descubrimiento de TAK-981, un inhibidor primero en su clase de la enzima activadora de SUMO para el tratamiento del cáncer. J.Med. química 64, 2501–2520 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Geis, FK et al. CHAF1A/B median en el silenciamiento de los ADN del VIH-1 no integrados en las primeras etapas de la infección. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 119, e2116735119 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jordan, A., Bisgrove, D. & Verdin, E. El VIH establece de manera reproducible una infección latente después de una infección aguda de células T in vitro. EMBO J. 22, 1868–1877 (2003).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Osborn, L., Kunkel, S. & Nabel, GJ El factor de necrosis tumoral alfa y la interleucina 1 estimulan el potenciador del virus de la inmunodeficiencia humana mediante la activación del factor nuclear kappa B. Proc. Academia Nacional. ciencia USA 86, 2336–2340 (1989).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chavez, L., Calvanese, V. & Verdin, E. La latencia del VIH se establece directa y tempranamente en las células T CD4 primarias tanto en reposo como activadas. Patog de PLoS. 11, e1004955 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Dahabieh, MS, Ooms, M., Simon, V. & Sadowski, I. Un reportero de VIH-1 doblemente fluorescente muestra que la mayoría del VIH-1 integrado está latente poco después de la infección. J.Virol. 87, 4716–4727 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Siliciano, RF & Greene, WC Latencia del VIH. Harb de primavera fría. Perspectiva. Medicina. 1, a007096 (2011).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Bui, JK et al. Los provirus con secuencias idénticas comprenden una gran fracción del reservorio de VIH competente para la replicación. Patog de PLoS. 13, e1006283 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Lorenzi, JCC et al. Evaluación cuantitativa y cualitativa emparejada del reservorio de VIH-1 competente para la replicación y comparación con el ADN proviral integrado. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 113, E7908–E7916 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Reeves, DB et al. La mayor parte de la persistencia del VIH durante la terapia antirretroviral se debe a la proliferación de células infectadas. Nat. común 9, 4811 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Hosmane, NN et al. Proliferación de células T CD4+ infectadas de forma latente que portan VIH-1 competente para la replicación: papel potencial en la dinámica del reservorio latente. Exp. J. Medicina. 214, 959–972 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, E. et al. Las células T CD4+ de memoria que expresan HLA-DR contribuyen a la persistencia del VIH durante la terapia antirretroviral prolongada. Frente. Microbiol. 10, 2214 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Horsburgh, BA et al. Los altos niveles de VIH genéticamente intacto en las células T de memoria HLA-DR+ indican su valor para los estudios de reservorio. SIDA 34, 659–668 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Tran, T.-A. et al. Células T CD4 reguladoras en reposo: un sitio de persistencia del VIH en pacientes con terapia antirretroviral eficaz a largo plazo. PLoS ONE 3, e3305 (2008).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Cantero-Pérez, J. et al. Las células T de memoria residentes son un reservorio celular para el VIH en la mucosa cervical. Nat. común 10, 4739 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Jordan, A., Defechereux, P. & Verdin, E. El sitio de integración del VIH-1 en el genoma humano determina la actividad transcripcional basal y la respuesta a la transactivación de Tat. EMBO J. 20, 1726–1738 (2001).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Han, Y. et al. Los linfocitos T CD4+ en reposo de individuos infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) portan genomas integrados del VIH-1 dentro de los genes del huésped transcritos activamente. J.Virol. 78, 6122–6133 (2004).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, AS et al. Las características de integración del VIH-1 latente intacto en clones de células T CD4+ contribuyen a la persistencia viral. Exp. J. Medicina. 218, e20211427 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Einkauf, KB et al. Los provirus del VIH-1 intactos se acumulan en distintas posiciones cromosómicas durante la terapia antirretroviral prolongada. J. Clin. Invertir. 129, 988–998 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Artesi, M. et al. PCIP-seq: secuenciación simultánea de genomas virales integrados y sus sitios de inserción con lecturas largas. Genoma Biol. 22, 97 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cole, B. et al. La caracterización exhaustiva de los reservorios de VIH-1 revela vínculos con la viremia plasmática antes y durante la interrupción del tratamiento analítico. Rep. Celular 39, 110739 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Whisnant, AW et al. Análisis en profundidad de la interacción del VIH-1 con la biogénesis del microARN celular y los mecanismos efectores. mBio 4, e000193 (2013).

Artículo PubMed Google Académico

Mefferd, AL, Bogerd, HP, Irwan, ID y Cullen, BR Información sobre los mecanismos que subyacen a la inactivación de los provirus del VIH-1 mediante CRISPR/Cas. Virología 520, 116–126 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Myers, G. et al. Human Retroviruses and AIDS 1994 Technical Report No. LA-UR–94-4171, 10116202 (Departamento de Energía de EE. UU., Oficina de Información Científica y Técnica, 1995); https://doi.org/10.2172/10116202

Li, W. et al. Control de calidad, modelado y visualización de pantallas CRISPR con MAGeCK-VISPR. Genoma Biol. 16, 281 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, B. et al. Análisis integrativo de pantallas genéticas CRISPR agrupadas usando MAGeCKFlute. Nat. Protocolo 14, 756–780 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sanjana, NE, Shalem, O. y Zhang, F. Vectores mejorados y bibliotecas de todo el genoma para la detección de CRISPR. Nat. Métodos 11, 783–784 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Butler, SL, Hansen, MS & Bushman, FD Un ensayo cuantitativo para la integración del ADN del VIH in vivo. Nat. Medicina. 7, 631–634 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Livak, KJ & Schmittgen, TD Análisis de datos de expresión génica relativa mediante PCR cuantitativa en tiempo real y el método 2(−Delta Delta C(T)). Métodos 25, 402–408 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Tsai, K. et al. La adición epitranscriptómica de m6 A regula la estabilidad del ARN del VIH-1 y el empalme alternativo. Genes Dev. 35, 992–1004 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pardons, M., Fromentin, R., Pagliuzza, A., Routy, J.-P. & Chomont, N. Los agentes que revierten la latencia inducen respuestas diferenciales en distintos subconjuntos de células T CD4 de memoria en individuos que reciben terapia antirretroviral. Informe celular 29, 2783–2795.e5 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Descargar referencias

Esta investigación fue apoyada por la subvención NIH R21-AI157616 a BRC y recibió apoyo de infraestructura de Duke CFAR (P30-AI064518).

Departamento de Genética Molecular y Microbiología, Centro Médico de la Universidad de Duke, Durham, NC, EE. UU.

Ishak D. Irwan, Hal P. Bogerd y Bryan R. Cullen

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

BRC concibió el proyecto. IDI y BRC diseñaron los experimentos. IDI y HPB realizaron los experimentos. IDI y BRC analizaron los datos. IDI y BRC escribieron el manuscrito con aportes de HPB

Correspondencia a Bryan R. Cullen.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Microbiology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

(ab) Poblaciones policlonales de células CEM-SS Cas9 transducidas con 2 sgRNA diferentes específicos para los genes indicados y luego infectadas con (A) IN-NL-GFPΔEnv, y (B) IN-NL-NLucΔEnv reporter virus. El % de células GFP+ en A se determinó mediante citometría de flujo a 2 ppp. La expresión de NLuc en B se normalizó a células CEM-SS Cas9 transducidas con un sgRNA codificado, que se estableció en 1,0. Los datos que se muestran en el panel B representan el promedio de tres réplicas biológicas con SD indicada.

Datos fuente

Cada una de las líneas celulares clonales inactivadas indicadas se lisó y luego se sometió a análisis de transferencia Western utilizando anticuerpos comerciales específicos para el componente del complejo SMC5/6 indicado. Actina se utilizó como control de carga. Las transferencias representativas que se muestran aquí son indicativas de al menos 3 réplicas biológicas.

Datos fuente

(a) Curvas de crecimiento de 7 días para células CEM-SS Cas9 no infectadas, o los clones ∆SMC5 y ∆SLF2 CEM-SS, contando el total de células vivas en cultivo. ( b, c ) Las líneas celulares indicadas se infectaron con IN + / IN- HIV-1 y los niveles de ( B ) ADN 2LTR no integrado y ( c ) ADN de VIH-1 integrado se cuantificaron mediante qPCR y Alu-qPCR respectivamente. Los niveles de ADN se normalizaron a células CEM-SS Cas9 infectadas con VIH-1 IN + a 1 ppp, que se estableció en 1. Los datos que se muestran representan el promedio de tres réplicas biológicas con SD indicada. ( d ) Las líneas celulares CEM-SS knockout clonales indicadas se infectaron con IN + o IN- NL-NLucΔEnv y luego se analizó la expresión viral de NLuc a 2 ppp. Los niveles de NLuc se proporcionan en relación con las células WT CEM-SS Cas9 infectadas con IN-NL-NLucΔEnv (Control), que se fijó en 1,0. Promedio de tres réplicas biológicas con SD indicada. Los datos se analizaron utilizando ANOVA unidireccional, prueba LSD de Fisher (valores de p indicados en el gráfico, ****p < 0,0001).

Datos fuente

Las líneas celulares indicadas se infectaron con IN + e IN- NL-GFP y se sometieron a ChIP-qPCR a 2 ppp para cuantificar los niveles de las modificaciones de histonas activadoras H3Ac y H3K4me3 y las modificaciones represivas H3K9me3 y H3K27me3 unidas al ADN viral LTR. (a) H3Ac y (b) H3K4me3 (c) H3K9me3, (d) histona total H3 y (e) H3K27me3. Promedio de tres réplicas biológicas con SD indicada. Los datos se analizaron con ANOVA de 2 vías, prueba de Sidak (****p < 0,0001; IN-H3K4me3 ΔSMC5: ***p = 0,0009; IN-H3K4me3 ΔSLF2: ***p = 0,0007).

Datos fuente

Las células CEM-SS Control y ΔSMC5 se infectaron con cantidades iguales de versiones Vpr+ y Vpr- del virus indicador IN-NL-GFPΔEnv, medido por ELISA, y la expresión de GFP analizada por citometría de flujo a 3 ppp. (a) Perfiles de fluorescencia de un experimento representativo. ( b ) Cuantificación de las medias de 3 réplicas biológicas independientes con SD indicada.

Datos fuente

( a ) Las células WT o ΔSMC5 CEM-SS se infectaron con IN + NL-GFPΔEnv pseudotipado VSV-G en presencia o ausencia de TAK-981 a una MOI de ~ 0.1. Las células se clasificaron mediante FACS a 3 ppp y las células GFP- (seleccionadas en rojo) se recolectaron para los experimentos informados en la Fig. 4a. (b) El nivel de ADN de 2LTR de VIH-1 no integrado se cuantificó mediante qPCR en células CEM-SS infectadas con VIH-1 WT hasta 7 ppp, cuando disminuyó a niveles de fondo. Promedio de 3 réplicas biológicas con SD indicada. Los datos se normalizaron a la señal a 2 ppp, que se fijó en 1,0.

Datos fuente

Se infectaron células WT o ΔSMC5 CEM-SS con IN + NL-GFPΔEnv en presencia y ausencia del inhibidor de la integrasa raltegravir. Estas células se infectaron con una multiplicidad de infección (MOI) de modo que las células GFP+ tanto en +ral como en -ral eran aproximadamente idénticas cuando se clasificaron a 5 ppp, como se indica en el panel A. A 2 ppp, las células se lavaron para eliminar el raltegravir. y rechapado para permitir que ocurra la integración. Las células GFP- se aislaron mediante FACS a 5 ppp y se cultivaron durante otros 6 días (11 ppp) donde se trataron con diluyente (DMSO), TAK-981, PMA o TNF-α. A continuación, las células se analizaron mediante citometría de flujo a 12 ppp para determinar la expresión de GFP. ( a ) Perfiles de expresión de GFP representativos de un solo experimento. ( b ) Compilación de 3 réplicas biológicas independientes, mostrando los medios y con SD indicados. Datos analizados por ANOVA de 2 vías, prueba de Tukey (****p < 0,0001).

Datos fuente

(a) En linfocitos T CD4+ primarios infectados con VIH-1 WT, el ADN del VIH-1 no integrado alcanza su punto máximo a los 2 ppp y disminuye a los niveles de fondo a los 7 ppp, según lo medido por análisis qPCR de ADN viral circular 2LTR. Estos datos representan el promedio de cinco réplicas biológicas usando células T CD4+ obtenidas de cinco donantes de sangre separados, con SD indicada. Los datos se normalizaron a la señal detectada a 2 ppp, que se fijó en 1,0. (b) Análisis estadístico de las subpoblaciones GFP/mCherry indicadas en células infectadas con el virus indicador de VIH-1 de doble color y tratadas con TAK-981 150 nM a 6 ppp frente a diluyente (DMSO) a 0 ppp. Las células infectadas se recogieron a 7 ppp y se analizaron mediante FACS. Estadísticas calculadas con una prueba t pareada de relación de dos colas.

Datos fuente

Las células T vivas se seleccionaron en un gráfico de dispersión frontal frente a lateral en función de su tamaño y granularidad. Las celdas individuales se seleccionaron en un gráfico de altura de dispersión frontal frente a área de dispersión frontal para eliminar los dobletes. Las puertas para las células GFP+ y/o GFP- se definen según los controles no infectados y son evidentes en las cifras finales.

Información suplementaria.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Western blot sin procesar.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Western blot sin procesar.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Irwan, ID, Bogerd, HP & Cullen, BR El silenciamiento epigenético por el complejo SMC5/6 media la latencia del VIH-1. Nat Microbiol 7, 2101–2113 (2022). https://doi.org/10.1038/s41564-022-01264-z

Descargar cita

Recibido: 23 mayo 2022

Aceptado: 10 de octubre de 2022

Publicado: 14 noviembre 2022

Fecha de emisión: diciembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-022-01264-z

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Nature Reviews Biología celular molecular (2023)